全血标本DNA PCR反应模板的制备

试剂与配制

蛋白酶K：20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5

TE缓冲液（pH7.5 或8.0）

PBS（磷酸盐缓冲液）

钾缓冲液：50mmol/L KCl，10～20mmol/L Tris-Cl，2.5mmol/L MgCl(pH8.3)，1%laureth12，0.5% Tween-20，蛋白酶K（100μg/ml）

裂解缓冲液：0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-Cl，5mmol/LMgCl2，1% Triton-100

操作方法

方法一

1. 无菌取血200μl置于含有50μl15%EDTA的EP管中混匀；

2. 12000rpm离心5min，弃上清；

3. 将细胞团悬浮于50μl溶液(10mmol/L Tris-HCl pH7.6，5mmol/L MgCl2， 10mmol/L NaCl) 中，12000rpm离心5s，去上清；

4. 重复 （3） 2～3次；

5. 将沉淀的细胞悬浮于100μl双蒸水中，煮沸5min；

6. 12000r/min离心5min，去细胞碎片；

7. 取上清2～5μl进行PCR扩增。

方法二

1. 取全血50μl于微量离心管中，加入0.5μlTE混匀；

2. 12，000g 离心10s，弃上清，加入0.5μlTE悬浮沉淀，再离心，重复此步骤2次以上；

3. 用100μl钾缓冲液悬浮沉淀，56℃水浴45min，消化细胞；

4. 95℃ 保温10min，灭活蛋白酶K，取10μl上清进行100μl PCR反应。

方法三

1. 在微量离心管中，将0.75ml全血和0.75ml裂解液混匀；

2. 10,000g离心30s，去上清，加入1.5ml裂解液悬浮沉淀。重复此步骤2次；

3. 用117μl含1%SDS的10mmol/L的Tris-Cl（pH8.0）缓冲液溶解沉淀，70℃水浴5min；

4. 冷至55℃，加入4μl蛋白酶K液，55℃1hr；

5. 95℃ 保温10min，灭活蛋白酶K；

6. 加入2mol/L KCl 30μl，冰浴5min；

7. 10,000g离心5min，上清分装后于-70℃储存备用。

方法四

1. 取20μl冷冻保存血或EDTA抗凝血，点加于2.5cm2玻璃纤维滤膜上，晾干；

2. 用铅笔沿血迹划一圆圈，将滤膜置于多孔支持物上，用蒸馏水裂解；

3. 用盐水或水浸洗，除去抑制PCR的蛋白质成分；

4. 晾干后，切取1/8的斑点置于PCR反应液中进行PCR。