《如何提取总蛋白？》

      大家目前最常用的方法是利用溶液法进行蛋白提取（如 RIPA 裂解液），但是往往会在蛋白质提取中产生两个不同的组分，即 RIPA 可溶性和 RIPA 不可溶性组分。通常 RIPA 不可溶性组分被我们直接丢弃忽略。但是已经有文章证实许多蛋白质存在于被丢弃的 RIPA 不可溶性组分中。也就是说利用溶液法提取的并非是完整的总蛋白，而仅仅是一些可溶性蛋白。

      溶液法进行提取蛋白时会人工激活 caspase-3 和 caspase-7；还会人工激活某些激酶活性；影响磷酸化研究；影响细胞外基质；影响定量，定性蛋白研究。目前利用离心管柱式法进行蛋白提取，即可解决以上这些问题，只需加入裂解液，过柱离心，不产生不可溶组份，即可提取到完整的总蛋白！

      动物组织总蛋白提取

变性总蛋白提取（SD-001）

以下步骤是从 15-20 mg 组织中提取，对于昆虫组织，例如果蝇，使用 15-20 个幼虫，蛹或成虫样本。如果起始量较大或者较小，需调整相应裂解液的用量比例。

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨 50-60 次，加入 200ul 细胞裂解液，继续研磨 30-60 次。（组织用量不要过量，无需过度研磨，裂解液可分两次加入以得到最佳效果）注意：塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干。

3. 盖上盖子室温孵育 1-2 分钟，14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。

4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。
请注意：部分未完全裂解的组织不会影响样品质量。

      天然总蛋白提取（SN-002）

1. 将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 将 15-20 mg 组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨 50-60 次，加入 200ul 天然细胞裂解液（SN-002），继续研磨 30-60 次。（组织用量不要过量，无需过度研磨，裂解液可分两次加入以得到最佳效果）。注意：塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干。

3. 开盖冰上孵育 5 分钟，盖上盖子，4℃，14000-16000rpm 离心 1-2 分钟取出。

4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

       细胞样品总蛋白提取

       变性总蛋白提取（SD-001）

       A．非贴壁细胞

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。
2. 低速离心收集细胞，在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS，旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清，剩余与细胞体积相同体积的 PBS。涡旋震荡重悬细胞。

3. 加入表格 1 中相应体积的细胞裂解液，涡旋震荡裂解细胞。（细胞数量和裂解液须保证对应关系，以达到最佳提取效率）请注意：部分未完全裂解的细胞不会影响样品质量。
4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出

5. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 1，不同细胞体积应加入相应体积裂解液

﹡ NIH3T3 和 293T 细胞 10ul 体积相当于 1X106 个细胞

       B． 贴壁细胞

1. 将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷
2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞，吸去上清。

3. 按照表 2 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面，用移液器吹打几次，将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出。（如提取浓度不佳，可减少裂解液使用量）
4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 2，不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

      天然总蛋白提取（SN-002）

      A．非贴壁细胞
1. 将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 低速离心收集细胞，在 1.5 ml 离心管中加入预冷的 PBS, 旋窝震荡,3000rpm 离心 2-3 分钟清洗细胞。吸去上清，剩余与细胞体积相同体积的 PBS。旋窝震荡重悬细胞。
3. 加入表格 3 中相应体积的细胞裂解液，涡旋震荡裂解细胞 15 秒。将离心管放置于冰上 3-5 分钟然后涡旋震荡 10 秒。（细胞数量和裂解液须保证对应关系，以达到最佳提取效率）

4. 将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出
5. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 3，不同细胞体积应加入相应体积裂解液

﹡ NIH3T3 和 293T 细胞 10ul 体积相当于 1X106 个细胞

     B 贴壁细胞

1. 将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2. 将预冷的 PBS 直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞两次，吸去上清。

3. 按照表 4 中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面，放置于冰上孵育 5 分钟，用移液器吹打几次，将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000rpm 离心 30 秒取出。（如提取浓度不佳，可减少裂解液使用量）
4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格 4，不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液