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蛋白质技术

WB 过程中常见问题及建议大汇总

2024-04-17 蛋白质技术 加入收藏
Western 免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。

       Western 免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。


       WB 实验中常会出现各种问题,迪申生物技术(上海)有限公司专注于生产免疫组化相关产品多年,对 WB 实验有一定了解,今天跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策。


问题可能原因建议
电泳条带成笑脸状胶不均匀冷切,中间冷却不好,电泳系统温度偏高减少电压减慢电泳速度,在冷室或者冰浴中进行电泳
电泳条带成皱眉状可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全调整装置
拖尾样品溶解不好样品充分溶解混匀后上样
纹理(纵向条纹)样品中含有不溶性颗粒样品充分搅拌混匀
条带偏斜电极不平衡或者加样位置偏斜调整电极和加样
条带两边扩散加样量过多适当减少上样量
Marker 变黑色抗体和 Marker 蛋白反应在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样
背景高膜封闭不够延长封闭时间,选择最适宜的抗体稀释度
一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度
一抗孵育的温度偏高建议 4℃ 结合过夜
二抗浓度度过高降低二抗浓度
二抗的非特异性背景增加一个二抗对照,不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)
二抗孵育时间过久减少二抗孵育时间
选择膜的问题硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低
膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润
检测时曝光时间过长注意曝光时间的缩短
洗膜不充分增加洗膜的时间和次数
抗体和封闭蛋白有交叉反应检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应
杂带较多目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点,糖基化位点,乙酰化位点等),本身可以呈现多条带查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白试剂大小
目的蛋白有其他剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性
样品处理过程中目的蛋白发生降解裂解液中加入蛋白酶抑制剂,样品处理在冰上进行
上样量过高,太敏感适当减少上样量
一抗不纯纯化抗体
一抗特异性不高重新选择或制备高特异性的抗体
二抗的非特异性结合增加一个二抗对照,不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)
一抗或二抗浓度偏高降低抗体浓度
细胞传代较多,导致蛋白变异使用原代或传代少的细胞作对照
蛋白条带位置
(大小)不对
二聚体或多聚体存在增加蛋白质变性过程及强度
翻译后剪切比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,在执行功能时需要进行剪切成活化的形式
相对电荷氨基酸电荷的组成
蛋白修饰比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加
胶浓度不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差
无蛋白条带抗体孵育不充分增加抗体浓度,延长孵育时间
酶失活直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因
试剂之间不匹配一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性
一抗失效选择在有效期内抗体,幷选择现配现用的工作液
HRP 抑制剂所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应认真阅读抗体说明书,确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白
二抗与一抗不匹配选择针对一抗来源种属的抗体
蛋白条带信号弱抗体孵育不充分增加抗体浓度,延长孵育时间
酶活性降低直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
洗膜过度洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20
标本中靶蛋白含量太低增加样本上样量
抗体活性降低选择有效期内的抗体,工作液现配现用,避免长时间放置
蛋白转移不充分可以用丽春红染膜幷结合染胶(考马斯蓝)后确定条带是否转移到膜上或转移过度,适当调整转膜的时间和电流
封闭过度减少封闭剂的量或缩短时间,换用不同封闭剂类型
曝光时间过短延长曝光时间
HRP 抑制剂所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠
背景有黑色斑点抗体与封闭试剂反应使用前过滤封闭试剂
HRP 偶联二抗中有聚集体过滤二抗试剂,去除聚集体
暗背景上白色带HRP 含量过高降低酶联二抗的浓度
背景有不均匀的白色斑点转膜过程中有气泡存在仔细检测,避免存在气泡
抗体分布不均匀孵育抗体时使用摇床



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