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蛋白质技术

醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质并定量

2024-04-17 蛋白质技术 加入收藏
一、原理 血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0,在pH8.6巴比妥缓冲液中,它们均电离成阴离子,在电场中向阴极泳动。由于各种蛋白质在同一pH环
一、原理


       血清中各种蛋白质的等电点大都低于pH7.0,在pH8.6巴比妥缓冲液中,它们均电离成阴离子,在电场中向阴极泳动。由于各种蛋白质在同一pH环境中所带电荷多少及分子大小不同,所以在电场中的泳动速度不同。一般所来,蛋白质分子量小而带电荷多者,泳动速度快,分子量大而带电荷少者泳动速度慢,因此可以利用其泳速不同将之分开。

       血清中含有清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组成、分子量、等电点及形状不同,在电场中的迁移速度不同。


       本实验用醋酸纤维素薄膜作为支持物进行电泳,分离各种血清蛋白。正常人血清在pH8.6的缓冲体系中电泳,染色后可显示5条区带,从阳极到阴极依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白。

       醋酸纤维素素薄膜是由二乙酸纤维素加工制成,具有均一的泡沫结构,厚度仅120 mm。醋酸纤维素素薄膜作为是电泳支持体有以下优点:

1. 电泳后区带界限清晰。

2. 通电时间较短(二十分钟至一小时)。

3. 它对各种蛋白质(包括血清白蛋白,溶菌酶及核糖核酸酶)都几乎完全不吸附,因此拖尾现象。

4. 对染料也没有吸附,因此不结合的染料能完全洗掉,无样品处几乎完无色。它的电渗作用虽高但很均一,不影响样品的分离效果,由于醋酸纤维素素薄膜水量较低,因此必需在密闭的容器中进行电泳,并使用较低有电流避免蒸发。


       由于醋酸纤维素素薄膜作为支持物进行蛋白电泳,具有以上优点。故本实验最终采用此种方法分离血清蛋白质并加以定量。


二、材料


1. 器材


醋酸纤维素薄膜(2×8 cm),培养皿,点样器,电泳仪,电泳槽,粗滤纸,镊子。


2. 材料


新鲜血清(未溶血)。


3. 试剂


(1)巴比妥缓冲液(pH 8.6,离子强度0.06):巴比妥1.66 g, 巴比妥钠12.76 g,加水至1000 ml。置4℃冰箱保存,备用。


(2)染色液:氨基黑10B 0.5 g, 甲醇50 ml,冰醋酸10 ml,蒸馏水40 ml,混匀。


(3)漂洗液:含95%乙醇45 ml,冰醋酸5 ml,蒸馏水50 ml,混匀。


(4)透明液:冰醋酸25 ml,无水乙醇75 ml,混匀。


三、方法


1. 准备电泳槽


电泳槽内放入巴比妥缓冲液。电泳槽应密闭使蒸汽饱和,避免水分蒸发。将电泳槽与电泳仪接好。


2. 点样


(1)浸泡:用镊子取醋酸纤维素薄膜1张(识别光泽面和无光泽面),无光泽面朝下小心平放在盛有缓冲液的培养皿中,浸泡30 min 左右(浸至无白斑)。


(2)点样:将浸透的薄膜从缓冲液取出(无光泽面朝上),用滤纸吸干多余的液体。点样时,先在点样器上均匀地沾上血清,在距阴极端1.5 cm 处将点样器轻轻地印在薄膜上,使血清完全渗透至薄膜内,形成一定宽度、粗细均匀的直线后迅速离开。


3. 电泳:


电泳槽架上分别用4层纱布连接电泳槽。将点样后的薄膜条置于纱布上,点样面朝下,点样端置于负极侧,薄膜条应平直,并与纱布紧贴。盖好电泳槽盖,静止平衡5 min 后通电,调节电压10~15 V/cm,电流0.5 mA/cm,电泳30~60 min。


4. 染色与漂洗:


(1)电泳完毕后将薄膜取下, 放在染色液中浸泡1~2 min。


(2)漂洗:将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次,直至背景蓝色脱净。取出薄膜放在滤纸上,晾干。


5. 定量


(1)洗脱比色:将各蛋白质区带仔细剪下,分置各试管中,另从空白背景剪块平均大小的膜条置于空白管中。各管加入0.4 mol/l NaOH 4 ml,于37℃水浴20分钟(不时振荡),待颜色脱净即用波长620 nm 比色,以空白管调零读m各管吸光度。


(2)计算:


吸光度总和(T)=A+α1+α2+β+γ(吸光度)


血清蛋白组分的相对百分数:


A % = A/T×100%


α1 % = α1/T×100%


α2 % = α2/T×100%


β % = β%/T×100%


γ % = γ%/T×100%
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