固定抗血清-稀释病毒法中和试验

中和试验（neutralization test）是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的一种方法。凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体，因为病毒要依赖于活的宿主系统复制增殖，因此，中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和培养细胞中进行。
固定抗血清-稀释病毒法用中和试验方法鉴定病毒时，将不同稀释倍数的病毒与标准的抗血清（20 个抗体单位／单位体积）混合、孵育，使两者充分反应，然后将混合液接种到敏感宿主体内，观察试验结果。

中和试验的基本原理是特异性的抗病毒抗体（中和抗体）与病毒结合之后，使病毒失去吸附、穿入宿主细胞的能力，从而阻止了病毒在宿主细胞内的复制和病毒感染机体的过程。进行中和试验时，首先将病毒与抗体在适当的条件下混合、孵育后，接种给敏感宿主，然后观察病毒感染敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。用敏感动物进行中和试验时，主要观察抗体能否保护易感动物免于死亡、瘫痪；用细胞培养法进行中和试验时，主要观察抗体能抑制病毒的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）或病毒空斑形成（virusplaque formation）等；用鸡胚接种法进行中和试验时，主要通过观察绒毛尿囊膜上的痘疮结构来检测病毒，或用血凝试验检测鸡胚尿囊液流感病毒的滴度。

器材：

①一次性无菌手套

②培养箱

③注射器

④细菌滤器

试剂：

①宿主：敏感细胞、敏感动物、鸡胚；

②已知标准的抗病毒血清（20 个抗体单位／0.1 mL）和已知阴性血清（56℃30 分钟灭活）；

③病毒分离物

固定抗血清-稀释病毒法中和试验的基本过程可分为如下几步（以细胞培养为例）：

①用细胞维持液连续 10 倍稀释病毒分离物（10-8～10）；

②取 0.6 mL 不同浓度的病毒稀释液与 0.6 mL 标准的抗病毒血清混合；

③再取 0.6 mL 不同浓度的病毒稀释液与 0.6 mL 已知的阴性血清混合；

④将混合液置 37 ℃ 水浴 1 小时，然后取 0.2 mL 混合液分别接种于细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每一稀释度接种 5 孔，设 5 孔正常细胞对照；

⑤将细胞培养板置 37 ℃、5％CO2 温箱中孵育，每日观察细胞病变效应 (CPE)。

⑥中和试验的病毒 CCIDso 的计算：细胞培养中，通常是以病毒的组织半数感染量（CCIDsd／单位体积）作为中和反应的终点。而动物试验中，用动物半数致死量（LDso／单位体积）作为中和反应的终点。中和试验中，抗血清组的 CCIDs。与阴性血清组的 CCID50 对数之差等于或大于 2，才能说明中和试验结果为阳性。

（1）病毒悬液：低温保存，多次分装，避免反复冻存。

（2）抗血清：常需要在 56 ℃ 灭活 30 分钟，避免一些非特异性物质增强抗体中和作用，和灭活病毒。

（3）孵育温度和时间：37 ℃ 1 小时。