空斑减少法中和试验

中和试验（neutralization test）是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的一种方法。凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体，因为病毒要依赖于活的宿主系统复制增殖，因此，中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和培养细胞中进行。
空斑减少法是在细胞培养上进行病毒中和试验，近年来多采用空斑减少法。先将病毒稀释成适当浓度，使每 0.2 ml 含 80～100 个 PFU（空斑形成单位），与不同稀释度的待检血清等量混合，置 37℃ 作用 1～2 小时，分别测定 PFU，使空斑减少 50％ 血清稀释度即为该血清的中和效价。

中和试验的基本原理是特异性的抗病毒抗体（中和抗体）与病毒结合之后，使病毒失去吸附、穿入宿主细胞的能力，从而阻止了病毒在宿主细胞内的复制和病毒感染机体的过程。进行中和试验时，首先将病毒与抗体在适当的条件下混合、孵育后，接种给敏感宿主，然后观察病毒感染敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。用敏感动物进行中和试验时，主要观察抗体能否保护易感动物免于死亡、瘫痪；用细胞培养法进行中和试验时，主要观察抗体能抑制病毒的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）或病毒空斑形成（virusplaque formation）等；用鸡胚接种法进行中和试验时，主要通过观察绒毛尿囊膜上的痘疮结构来检测病毒，或用血凝试验检测鸡胚尿囊液流感病毒的滴度。

器材：

①一次性无菌手套

②培养箱

③注射器

④细菌滤器

试剂：

①宿主：敏感细胞、敏感动物、鸡胚；

②已知标准的抗病毒血清（20 个抗体单位／0.1 mL）和已知阴性血清（56℃30 分钟灭活）；

③病毒分离物

空斑减少法中和试验的基本过程可分为如下几步：

①将病毒稀释成适当浓度，使每 0.2 mL 含 80～100 个 PFU（空斑形成单位）

②不同稀释度的待检血清等量混合，置 37 ℃ 作用 1～2 小时

③分别测定 PFU，使空斑减少 50％ 血清稀释度即为该血清的中和效价。

（1）病毒悬液：低温保存，多次分装，避免反复冻存。

（2）抗血清：常需要在 56 ℃ 灭活 30 分钟，避免一些非特异性物质增强抗体中和作用，和灭活病毒。

（3）孵育温度和时间：37 ℃1 小时。