固定病毒-稀释抗血清法中和试验

中和试验（neutralization test）是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存病毒感染力的一种方法。凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体。

因为病毒要依赖于活的宿主系统复制增殖，因此，中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和培养细胞中进行。固定病毒——稀释抗血清法主要用于血清抗体滴度的测量。将 100 CCIDs／单位体积的病毒分别与连续倍比稀释的患者急性期或恢复期血清混合孵育 1 小时后，把混合液接种于敏感宿主，然后观察敏感宿主的情况。

中和试验的基本原理是特异性的抗病毒抗体（中和抗体）与病毒结合之后，使病毒失去吸附、穿入宿主细胞的能力，从而阻止了病毒在宿主细胞内的复制和病毒感染机体的过程。

进行中和试验时，首先将病毒与抗体在适当的条件下混合、孵育后，接种给敏感宿主，然后观察病毒感染敏感宿主的情况，即观察残存的病毒对宿主的感染力。

用敏感动物进行中和试验时，主要观察抗体能否保护易感动物免于死亡、瘫痪；用细胞培养法进行中和试验时，主要观察抗体能抑制病毒的细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）或病毒空斑形成（virusplaque formation）等；用鸡胚接种法进行中和试验时，主要通过观察绒毛尿囊膜上的痘疮结构来检测病毒，或用血凝试验检测鸡胚尿囊液流感病毒的滴度。

器材：一次性无菌手套、培养箱、注射器

敏感宿主：敏感细胞、敏感动物、鸡胚

已知病毒（已滴定的标准病毒，100 TCIDs／0.1 mL 或 100 LDs／0.1 mL）

试剂：急性期或恢复期血清（通常 56 ℃，30 分钟灭活）、细菌滤器试剂

固定病毒——稀释抗血清法中和试验的基本过程可分为如下几步（以细胞培养为例）：

（1） 用细胞维持液连续倍比稀释急性期和恢复期血清；

（2） 取 1.0 mL 不同浓度的稀释血清分别与 1.0 mL 标准病毒（100 CCIDs／0.1 mL）混合，置 37 ℃ 水浴作用 1 小时；

（3） 取混合液 0.2 mL 分别加到细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每一稀释度接种 4 孔细胞。同时设 4 孔正常细胞对照和 4 孔 100 CCIDs／0.2 mL 病毒对照；

（4） 设病毒滴度对照：将病毒液连续 10 倍稀释后，加到细胞已长成单层的 96 孔细胞培养板中，每个稀释度接种 4 孔细胞，每孔加 0.1 mL，必要时还要设抗体阳性血清对照和抗体阴性血清对照；

（5） 将 96 孔细胞培养板置 37 ℃、5% CO2 温箱中孵育，每日观察细胞病变效应（CPE）；

（6） 50％ 血清中和终点的计算：50% 细胞不产生细胞病变（CPE）的血清稀释度。根据细胞病变程度，用 Reed-Muench 法计算 50% 血清中和终点。

（1） 病毒悬液：低温保存，多次分装，避免反复冻存；

（2） 抗血清：常需要在 56 ℃ 灭活 30 分钟，避免一些非特异性物质增强抗体中和作用，和灭活病毒；

（3） 孵育温度和时间：37 ℃ 1 小时。