腺病毒包装流程、注意事项与常见问题

腺病毒介绍

重组腺病毒载体是基于人腺病毒 5 型（Ad5），其基因组是 36kb 长的线性双链 DNA，是一种复制缺陷型腺病毒载体系统。具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率可高达 100%；对外源基因容载能力大（可以高达 8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。

最常用的腺病毒包装体系有 AdEasy 和 AdMAX 两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，再重组到腺病毒的大骨架上。以上两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因 E1 和 E3 的缺陷（ΔE1，ΔE3），其中 E3 基因对病毒的产生并非必需。因此，腺病毒包装必需依赖表达 E1 的细胞系，例如 HEK-293，HEK-293A 等。

整体包装流程

图 1、 腺病毒包装实验流程图

表 1、腺病毒包装系统质粒

质粒构建和扩增

AdMAX 系统：构建连接目的基因的 pHBAdMAX质粒和pBHGlox(delta)E1, 3Cre 质粒并大量抽提，用于转染 293A 细胞。

AdEasy 系统：构建连接目的基因的 pHBAdEasy 质粒并进行酶切线性化；线性化后转入 BJ5183 感受态（含 pAdEasy-1 骨架质粒）进行重组，涂板培养单克隆并扩增，抽提质粒进行 PacI 酶切验证；验证正确的重组质粒转化 Stbl3 感受态，得到高纯度的重组质粒并进行 PacI 酶切线性化，用于转染 293A 细胞。

腺病毒包装

表 2、腺病毒包装转染体系

腺病毒收集

挑取 3-6 个空斑不等，放入1 ml新鲜培养基中过夜，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。（注：病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，可在培养液中加入低熔点琼脂糖，一般在转染后第 10 ~ 21 天可以在显微镜下看到小的空斑。）

腺病毒扩增

将培养基中的病毒加入新鲜 293A 细胞培养液中进行病毒少量扩增，至再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒（P1 代），感染 293A 细胞，连续进行三代感染，至 P4 代进行腺病毒的大量扩增并收集病毒。

腺病毒纯化

将病毒从 -80 ℃ 冰箱取出，室温水浴融化。在 4 ℃ 下，7000 g 离心 10 min，弃细胞碎片，收集上清，0.22 μm 过滤除菌即可用于细胞实验。若用于对腺病毒滴度和纯度要求高的动物实验，则需要采用 PEG8000 沉淀-CsCl 密度梯度离心-透析联用法进行纯化。

病毒重悬和保存

弃上清，500 μl 重悬液重悬病毒沉淀，一周内使用则置于 4 ℃ 保存，如需长时间存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。

1. 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2 级别）内操作。
2. 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3. 操作病毒时特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液请用84消毒液浸泡后统一处理。
4. 如需要离心，应使用密封性好的离心管，如有必要请用封口膜封口后离心。
5. 动物注射操作请在生物安全柜内（BL-2 级别）完成。
6. 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌处理。
7. 实验完毕用洗手液清洗双手。

1、腺病毒载体有几代，需要怎样选择？

第一代腺病毒载体：E1/E3 基因缺失的腺病毒载体称为第一代腺病毒载体；

第二代腺病毒载体：E2A/E4 基因缺失的腺病毒载体被称为第二代腺病毒载体，产生的免疫原性较低，载体容量和安全性方面均提高，但病毒包装难度和出毒滴度严重下降，应用受限。

第三代腺病毒载体：第三代载体缺失了全部的或大部分腺病毒基因，仅保留了两端 ITR 和包装信号。包装容量高达 35kb，免疫原性极低，载体中引入核基质附着区基因用于外源基因长期表达并增加了载体的稳定性。但第三代载体系统需要腺病毒突变体作为辅助病毒。

目前，第一代腺病毒载体仍是科研和临床应用最为广泛的腺病毒载体，因此更为推荐。

2、腺病毒的两种包装系统怎么选择？

需要根据自己实验室的经验以及需求进行选择。

• AdEasy 系统：操作步骤相对可控，AdEasy 系统得到的病毒滴度相对较高。AdEasy 系统是较常用的系统，在 BJ5183 感受态中完成环状腺病毒基因组的重组，将重组腺病毒基因组经 Pac I 酶切线性化后转染 293A 细胞。但重组腺病毒基因组的阳性率比较低，需要挑选大量的克隆进行验证。
• AdMax 系统：是直接将穿梭质粒和骨架质粒导入到包装细胞 293A 中，重组过程不可控，中间无法进行筛选，所以重组假阳性较高，筛选阳性结果的难度较 AdEasy 系统高很多。 但 AdMax 包装系统流程更简便易操作，适合新手研究人员。

3、腺病毒纯化的目的是什么？

纯化后的腺病毒可以去除缺损的病毒颗粒、细胞毒素、细胞培养基、以及细胞碎片等杂质。纯化腺病毒免疫原性较低，更适合做动物实验。

4、腺病毒感染毒斑和细胞聚集怎么进行区分？

镜下观察发现类似病毒空斑或者细胞聚集的现象时，应继续培养 1-3 天，观察聚集区域是否扩散，若持续扩散一般为病毒毒斑，若聚集区域保持不变，则一般为细胞聚集现象。