病毒滴度检测——腺病毒

细胞准备

培养 293A 细胞，待细胞生长密度约为 80-90 % 时，消化细胞并计数细胞量；

用含有 5% FBS 的 DMEM 培养液制备细胞悬液，按每孔 100 μL（1×10 4 个细胞）加入 2 个 96 孔板。

腺病毒滴度检测采用TCID50法：

滴度单位：PFU/mL，是空斑形成单位，为Plaque Forming Unit per mL的缩写。

1、加病毒

1. 将 96 孔板中的 11、12 两列各加入 100 μL 5% FBS 的 DMEM，做阴性对照；
2. 96 孔板中的 A-H 排，依次各加 100 μL 标记为 8 个连续梯度稀释的病毒样品溶液，盖上第一个板并在37°C CO 2 培养箱中培养；
3. 同样步骤操作第二块板；

实验中培养板的结构如下图：

2、观察结果并计算滴度

1. 将 96 孔板置于 37°C CO2 培养箱中培养 10 天，从第 3 天到第 10 天观察细胞状况。
2. 第 10 天分析、记录 CPE 结果：

CPE 应在 10 天之内出现。第 10 天在显微镜下观察每孔 CPE 情况，并与阴性对照的一排对比，记录每排样品的阳性孔数。

注意：如有一个板被污染，实验必须重做

     3. 病毒活性计算公式：

对于 100 μL 样品，滴度 T＝101+d（s-0.5） 

d＝log10 稀释度＝1（对于 10 倍的稀释度而言）

s＝阳性比率之和（从第一个 10 倍稀释度算起）

将 TCID50/mL 转换成 PFU/mL：

T＝a×10bTCID50/mL＝a×10b-0.7PFU/mL

两次重复实验得到的滴度值应相差 ≤100.7

以 Ad-GFP 滴度测定为例： 测定结果为 1.99×1011PFU/mL

滴度： T=101+(10.5-0.5)=1011.0TCID50/100uL

将 TCID50/mL 换算成 PFU/mL

T=1011.0-0.7/100uL=1010.3/100uL=1.99×1010PFU/100uL =1.99×1011PFU/mL

1. 稀释病毒液时要充分混匀。 每次吸病毒液时要更换 Tip 头，以防导致稀释不准确。
2. 本检测须做两组重复实验，两组实验可在同一天进行，也可在不同天进行。

Q: protocol 中所说的 CPE 和 TCID50 具体是指什么？

A：CPE（cytopathic effect）指的是病毒感染细胞后导致细胞出现病变效应，TCID50（tissue culture infective dose 50%）指的是半数组织培养感染剂量，即50%的细胞发生 CPE 时的病毒稀释度。

Q：什么是 VP、PFU、IU?

 A：不同的概念缘于不同的滴度测定方法，这些方法包括 2 类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、PFU、TCID50）。

VP：病毒颗粒（viral particle），是「活」（有感染性） 和「死」（无感染性）的腺病毒颗粒的总量。

PFU：空斑形成单位（plaque formation unit），是有感染性的「活」的腺病毒的总量，即腺病毒得活性单位。

IU：感染单位（infectious unit），和 PFU 一样，是另一种腺病毒活性单位。测定方法是 TCID50 法。

Q： TCID50 测定腺病毒滴度可以用 293t 细胞吗？

A：不可以，腺病毒确实 E1A 基因，该基因与病毒复制相关，293A 细胞是反向表达 E1A 基因的细胞系，腺病毒感染后可以复制扩增，293t 不能反向表达该基因，腺病毒感染后不能复制扩增。