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微生物学

亚硝基胍法

2024-04-19 微生物学 加入收藏
原理亚硝基胍(NTG,N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)是一种有效的化学诱变剂,在低致死率的情况下也有很强的诱变作用,故有超诱变剂之称。它的主要作用是

原理

亚硝基胍(NTG,N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍)是一种有效的化学诱变剂,在低致死率的情况下也有很强的诱变作用,故有超诱变剂之称。它的主要作用是引起 DNA 链中 GC→AT 的转换,亚硝基胍也是一种致癌因子,在操作中要特别小心,切勿与皮肤直接接触。凡有亚硝基胍的器皿,都要用 1 mol/L NaOH 溶液浸泡,使残余的亚硝基胍分解破坏。


材料与仪器

枯草芽孢杆菌 BF7658
淀粉培养基 LB 液体培养基 亚硝基胍 碘液 无菌生理盐水
玻璃涂棒 血细胞计数板 振荡混合器

步骤

1. 菌悬液制备


1.1 将试验菌斜面菌种挑取一环接种到含 5 ml 淀粉培养液的试管中,置37℃ 振荡培养过夜。


1.2 取 0.25 ml 过夜培养液至另一支含 5 ml 淀粉培养液的试管中,置 37℃ 振荡培养 6~7 h。


2. 平板制作


将淀粉琼脂培养基礅化,倒平板 10 套,凝固后待用。


3. 涂平板


取 0.2 ml 上述菌液放到一套淀粉培养基平板上,用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面。


4. 诱变


4.1 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶,然后将平板倒置于 37℃ 恒温箱中培养 24 h。


4.2 放在亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈(图 1)。


图 1 亚硝基胍平板诱变


5. 增殖培养


5.1 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到盛有 20 ml LB 液体培养基的三角瓶中,摇匀,制成处理后菌悬液,同时挑取远离抑菌圏的少许酋苔到另一盛有 20 ml LB 液体培养基的三角瓶中,摇匀,制成对照菌悬液。


5.2 将上述 2 只三角瓶置于 37℃ 振荡培养过夜。


6. 涂布平板


分别取上述两种培养过夜的菌悬液 0.1 ml 涂布淀粉培养基平板。处理后悬液涂布 6 套平板,对照菌悬液涂布 3 套平板。涂布后的平板,置 37℃ 恒温箱中培养 48 h。实际操作中可根据两种菌液的浓度适当地用无菌生理盐水稀释。注意每套平板背面作好标记,以区别经处理的和对照。


7. 观察诱变效应


分别向 cfu 数在 5~6 个左右的处理后涂布的平板内加碘液数滴,在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圏直径与蓠落直径并计算其比值(HC 比值)。与对照平板相比较,说明诱变效应,并选取 HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。


凡有亚硝基胍的器皿,都要置于通风处用 1 mol/L NaOH 溶液浸泡,使残余的亚硝基胍分解破坏,然后清洗。

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注意事项

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常见问题

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