微生物学

生物统计法

2024-05-09 微生物学加入收藏

一、简介大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。食品中大肠菌群数系以每100 g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the m

一、简介

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。食品中大肠菌群数系以每100 g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number 简称MPN）表示。本实验是根据大肠菌群乳糖发酵产气量并结合MPN检索表来最终测定食品中大肠菌群量。

二、操作方法

生物统计法

三、原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。食品中大肠菌群数系以每100 g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number 简称MPN）表示。

材料与仪器

乳肉蛋制品饮料糕点发酵调味品大肠埃希氏菌产气肠杆菌
单料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管伊红美蓝琼脂革兰氏染色液蛋白陈水靛基质试剂麦康凯
温箱水浴锅天平显微镜均质器乳钵温度计平皿试管发酵管吸管载玻片接种针

步骤

一、采样及稀释

1. 以无菌操作将校样25 g(或25 mL)放于含有225 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以800 r／min—1000 r／min的速度处理1 min，做成1：10的稀释液。

2. 用1 mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1 mL，注入含有9 mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。

3. 根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种3管。也可直接用样品接种。

二、乳糖初发酵试验

即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。

将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在1 mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1 mL及1 mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置(36土1) ℃培养箱内，培养(24土2) h，的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，勿有产生者，则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。

三、分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置(36土1) ℃温箱内，培养18 h一24 h，：然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。

四、乳糖复发酵试验

即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。

在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1—2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置(36士l) ℃的温箱内培养(24土2) h，观察产气情况。

凡乳糖发酵管产气．革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。

五、报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表(见表5—4)，报告每100 mL食品中大肠菌群的最可能数。

六、大肠菌群最可能数(MPN)检索表中数值的计算

大肠菌群最可能数检索表中数值，系通过几率计算出来的。由于我国在大肠菌群检验中，对检样采用了三个不同的lo倍递减接种量，每个接种量各接种丁3个乳糖胆盐发酵管。因此，乳糖阳性管可能只出现在一个管组内，也可能出现在两个管组内，或者三个管组内部出现。为此，就乳糖阳性管出现的这三种不同情况各举一例，以说明检索表中最可能数求出的情况。

1．仅有一组乳糖发酵管内有大肠菌群存在时．用公式（1）计算：
Nλ＝2.303×lgA/B （1）
N——检出大肠菌群的乳糖发酵管所加样品量；
λ——大肠菌群的最可能数，个／mL或个／g；
A——加进所有各管组乳糖发酵管内样品的总量；
B——所有各管组未检出大肠菌群管中样品的总量。
例1；管组 ① ② ③
管数 3 3 3
每管内样品量 10mI 10mL 10mL
阳性管数 3 0 0
因此，N＝10 A＝33.3 B＝3.3
代入公式(1) 得
10λ=2.303×lg33.3/3.3
=2.303×lg10.091
=2.3
λ＝0.23个／mI
所以每100mL样品内大扬菌群最可能数为23个。根据表5—4中样品接种量较例1低10倍，故其大肠菌群效应为230个。

2. 两组乳糖发酵管内有大肠菌群存在时，用公式(2)计算

式中 N1P——管组②每管内加N1mL(g)样品量，有P个大肠菌群阳性管；
N2γ——管组②每管内加N2mL(g)样品量，有γ个大肠菌群阳性管；
γ——大肠菌群的员可能数(个／mL或个／g)；
A——加进所有各管组乳糖发酵管内样品的总量；
B——所有各管组未检出大肠菌群管中样品的总量。

应用公式(2)时，须先假定λ值，用试算法代进公式内以计算出k值，当代进公式的假定值与计算出的λ值相符(或最接近时)时，则所假定的λ值，即为大肠菌群的最可能数。

例2：管数 ① ② ⑧
管数 3 3 3
每管内样品量 10mL 10mL 0.1mL
阳性管数 0 3 2
因此，N1=1 N1P=3 N2=0.1 N2γ=0.2 A=33.3 B=30.1

设λ=0.16个/mL，代入上式得：
lgK＝一0.4343×0.1×0.16
＝1.9930512
所以，K=0.98412712
将以上各值代入公式(2) 得：

＝2.303×0.0679963
＝0.1565955
此计算的λ值与所假设的λ值相符，因此大肠菌群最可能数为0.16个／mL，由表5-4中样品接种量较例3低10倍，故大扬菌群数应为160个。

3．三组乳糖发酵管内都有大肠菌群存在时，用公式 (3) 计算：

式中 A——加进所有各管组乳糖发酵管内样品的总量；
B——所有各管内未检出大肠菌群管中样品的总邑，
N1P——管组①每管加入N1 mL(g)样品，有P个大肠菌群阳性管；
N2γ——管组②每管加入N2 mL(g)样品，有γ个大肠菌群阳性管；
N3t——管组③每管加入N3 mL(g)样品，有t个大肠菌群阳性管；
λ——大肠菌群的最可能数，个／mL或个／g。
应用公式(3)时，与应用公式(2)相同，也须先假定λ值，用计算法代入公式内以计算出λ值，当代进公式的假定值与计算出的λ值相符(或最接近)时，则所假定的λ值，即为大肠菌群的最可能数。

例3：管数 ① ② ⑧
管数 3 3 3
每管内样品量 10mL 10mL 10mL
阳性管数 2 3 1
因此，N1=10 N1P=20 N2=1 N2γ=3 N3t=0.1 A=33.3 B=10.2

设λ＝0.36个／mL，代入①②③式可得；
lgK1＝-0.4343×l×0.36
＝一0.156348
所以，K1=0.69767312
lgK2＝0.4343×0.1×0.36
＝-0.0156348
K2＝0.96464
lgK2＝0.4343×（1+0.1）×0.36
＝-0.1719828
所以，K3＝0.6730033
将以上各值代入公式 (3) 得：
10λ＝2.303×