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微生物学

50%终点法

2024-04-23 微生物学 加入收藏
原理50% 终点 (50% endpoint) 法是将病毒悬浮液经一系列稀释后,接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞,将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变

原理

50% 终点 (50% endpoint) 法是将病毒悬浮液经一系列稀释后,接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞,将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做成曲线,找出造成 50% 动物、鸡胚死亡或细胞病变的终点稀释度。 LD50 (50 % Lethal dose) 为造成 50%动物或鸡胚死亡的病毒含量, ID50 (50 % Infectious dose) 即是指可造成 50%动物或鸡胚感染的剂量, CCID50 (50 % cell culture infectious dose) 为造成 50%细胞培养产生病变效应的剂量。

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材料与仪器

病毒
含 2%小牛血清的 Eagle's 维持液
细胞培养箱、细胞培养板

步骤

1. 制备细胞。


先制备好单层细胞培养物,在低倍显微镜下观察,挑选生长良好的细胞,按「传代细胞培养」法进行,将细胞单层洗涤、消化、计数。配制所需浓度的细胞悬液,细胞数目可因细胞种类而异,通常为 20 万 -30 万/ml。预先将微量细胞培养板设计好,标记;用微量加样器将细胞悬液加人微孔中,每孔 200µl。


2. 孵育细胞。


将装有细胞悬液的微孔板置于 5% CO2 培养箱中, 37℃培养直至细胞生长成良好的单层。


3. 接种病毒。


用含 2%小牛血清的 Eagle's 维持液作为稀释液,将待测病毒作连续 10 倍稀释,如 10-1 、 10-2 、 10-3 …… 10-10 等。将培养板中的培养液全部倾弃,用微量加样器把每个稀释度的病毒液依次、对号加入各个微孔,每孔 100µl, 每个稀释度加 4 孔,同时设细胞对照孔 4 孔,不加病毒,只加稀释液,置于 37℃ 5% CO2 培养箱中培养。


4.观察结果。


于培养后的不同时间,如 18 h 、 24 h 、 36 h 等,在倒置显微镜下观察细胞病变情况。表示细胞病变程度。 通观整个「单层区」,权衡总的情况,以下列符号表示其病变程度:


-:表示无细胞病变。


+:表示 1%——25% 的细胞有病变。


++: 表示 26%——50% 的细胞有病变。


+++:表示 51%——75% 的细胞有病变。


++++: 表示 76%——100% 的细胞有病变。


5.记录结果。


病毒引起细胞病变效应的滴度以半数细胞培养感染量 (50% cell culture infectious dose, CCID50)表示,即凡能使 50%(半数)细胞出现病变的最高病毒稀释度,即为 50%感染单位,简称 CCID50。有时也称其为半数组织培养感染量 (50 % tissue culture infectious dose, TCID50) 。细胞病变效应出现的时间,不同病毒不完全一样,以感染细胞的病变不再发展,而对照细胞仍完好为准。


6.计算。


(1)CCID50的计算


Reed-Muench 法计算CCID50(图片插入http://res.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2017/08/B15022615761176i7hmtaq3r.png)


Karber 法计算 CCID50


公式: lg CCID50< 或 LD50 、 ID50)=L+d(S- 0. 5)


L—病毒的最低稀释倍数的对数;


d—稀释系数,即组距;


s---细胞病变比值的和(不包括最低稀释度细胞病变的比值)。


图片插入:http://res.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2017/08/B15022616615769hmgu53nbg.png


(2)ID50 和 LD50的计算


ID50的计算与CCID50完全相同,但依接种动物或胚胎是否受感染而判定,感染与否的判定标准如家兔在接种猪瘟病毒之热反应,鸡胚胎接种新城疫病毒后血球凝集。


LD50计算方法与前两者完全相同,只是判定标准是以接种动物或胚胎是否死亡判定的。


(3)CCID50 与 PFUs 的换算


如果用同一细胞系做 CCID50试验和空斑形成单位 (PFUs) 试验, 1 ml 病毒液将会产生的PFUs 约相当于 CCID50 滴度的一半。此时的感染量为至少在单层细胞上出现 1个病毒空斑。而实际测量时,在单层细胞上可能出现 1个以上的病毒空斑,因此需要按实际测量的空斑数计算。若按数学公式推导,预期的 PFUs 将会超过 CCID50 滴度的一半。因为在 CCID50测量时,阴性代表在单层细胞上出现的空斑数为 0, 阳性代表在单层细胞上出现 1个或 1个以上的空斑。


按照泊松分布的公式 P(O) =e(-m),P(O) 代表阴性孔数的比例, m 代表 PFUs/ml, 因为任何CCID50的 P(O)=0.5,因此, e(-m) =0. 5,m= —ln 0. 5≈0. 7 。所以 0. 7 乘以CCID50的滴度即为预计的 PFUs 。

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注意事项

因细胞可受多种非特异因素的影响而发生病变,所以一定要先观察对照组细胞,再观察实验组细胞,同时在观察细胞有无病变时,尚应注意下列问题:


(1) 未适应现象:初分离的病毒或实验室低温保存过久的病毒,当将其感染细胞时,往往在开始时不出现病变,但继续盲传下去即会出现病变。


(2) 无病变现象:有些病毒虽能在细胞内繁殖,但却不出现病变。


(3) 细胞带病毒现象:因很多动物及鸡胚中常常有「潜伏性病毒」而造成细胞带病毒,故在分离病毒时应特别注意这个问题。此外,支原体的污染有时亦会碰到,这是比较难处理的问题。良好的细胞单层应是细胞界限清晰,胞浆内颗粒细致均匀,无融合细胞。

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常见问题

细胞病变主要有以下几种


1.整个细胞都发生改变,常表现为两种情况,其一是,胞核及整个细胞都发生肿胀、胞浆呈颗粒样变化、胞膜边缘不整齐;其二是,整个细胞发生皱缩、变圆直至碎裂脱落等。这一类的病变见于很多病毒,如肠道病毒、疮病毒、呼肠病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒等;


2.细胞聚合:如腺病毒;


3.细胞融合形成合胞体,即指多数病变细胞发生相互融合而呈「巨细胞」,但各个细胞的胞核仍可分辨,如副粘病毒、疤疹病毒;


4.细胞仅产生轻微病变,如正粘病毒、狂犬病毒、冠状病毒、逆转录病毒、沙粒病毒。


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