Pull-down实验大家族一览

蛋白-蛋白相互作用是蛋白质结构与功能研究中最重要的方面之一。今天我们来学习一个蛋白质体外结合实验——Pull-down实验，Pull-down实验，又称拉下实验，是一种体外亲和纯化技术，也是一种验证酵母双杂系统的体外试验技术。蛋白Pull-down可用于验证已知蛋白或肽的相互作用，也可以用来筛选与已知蛋白或肽互作的未知蛋白或肽。但是在一定程度上不能真实反应细胞内蛋白质之间的相互作用，因为在体外相互作用的蛋白质在正常生理条件下不一定会相互结合。

一、GST Pull-down

Pull down技术是通过固定一种诱饵蛋白来特异性吸附配体蛋白，以达到富集、分离、纯化某种配体蛋白的目的。为了更有效地利用Pull down技术，1988年，Smith等人利用GST融合标签从细菌中纯化出GST融合蛋白（Smith et al., 1988），将已知蛋白以融合蛋白的形式表达，亲和固化在GSH亲和树脂上，作为一种“诱饵蛋白”去捕获与之相互作用的“捕获蛋白”（目的蛋白），洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。

“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得，这种方法简单易操作。

基本原理：

GST Pull-down的原理主要是利用GST对GSH的亲和性，将GSH固定于琼脂糖珠上，形成GSH-琼脂糖珠，再通过DNA重组技术将已知蛋白X与GST融合，GST-X融合蛋白与GSH-琼脂糖珠形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X”复合物，若环境中存在与X蛋白互作的蛋白Y，则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互作的蛋白即可被分离并检测。

操作步骤：

样品处理—GST/His-诱饵蛋白原核表达载体构建—GST融合蛋白表达—GST融合蛋白纯化—Pull-down捕获猎物蛋白—SDS-PAGE电泳—Western blot或LC-MS/MS

二、DNA Pull-down

DNA pull-down是一种新颖的体外研究DNA与蛋白互作的实验技术。该技术以研究的DNA序列为探针，寻找与该序列结合的蛋白质，最常见的应用是寻找某个或者某些特定基因启动子区域的转录因子/组蛋白。

基本原理：

针对目标区域体外制备脱硫生物素标记的特异性DNA探针，使其与待测蛋白液孵育，可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合，形成“生物素化DNA-蛋白质”复合物。生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用，采用链霉亲和素磁珠将靶DNA及其结合蛋白从待测蛋白液中分离出来，洗涤后，将非特异性结合蛋白去除，最后，经洗脱液洗脱，得到目的DNA探针-蛋白质复合物，通过Western blot检测洗脱液中是否有待测蛋白；通过LC-MS/MS技术检测靶DNA的潜在结合蛋白并鉴定蛋白质类型。

操作步骤：

样品处理—探针标记—蛋白与探针共孵育—Western blot或LC-MS/MS检测

DNA Pull-down的优点:

1、可富集分析低丰度蛋白；

2、探针制备简便，周期短；

3、获得特异性蛋白与下游蛋白质检测技术兼容。

DNA Pull-down的缺点:

1、长链探针往往存在非特异结合现象；

2、反应条件要求无核酸酶；

3、体外实验，相对体内实验存在一定弊端。

三、RNA Pull-down

RNA涉及生命的所有领域，在许多基因表达过程、宿主防御机制、细胞增殖和疾病中发挥着关键作用。随着高通量测序技术的发展，越来越多的非编码RNA被注释出来，其广泛的生物学功能也成为近年来的研究热点。RNA与蛋白质的相互作用也是非编码RNA发挥功能的主要作用机制之一，其中，RNA pull down是用于检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间互作的主要实验技术之一，也是近年来研究非编码RNA（如IncRNA、circRNA）与蛋白质相互作用及生物学功能验证的主要手段。

基本原理：

RNA Pull-down作为研究RNA与蛋白互作的核心技术，是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，通过生物素与链霉亲和素的非共价亲和作用，使其与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，如果检测蛋白为已知蛋白，可通过Western blot实验检测特定RNA结合蛋白是否与RNA相互作用；如果检测未知蛋白，则可结合质谱（MS）进行鉴定特定RNA结合蛋白，以鉴定蛋白质类型。

操作步骤：

样品预处理—生物素探针标记RNA—RNA抽提—细胞裂解—磁珠富集RNA—RNA结合蛋白孵育—RNA结合蛋白洗脱—Western blot或LC-MS/MS检测

RNA Pull-down的优点：

1、可富集检测低丰度RBPs-RNAs复合物；

2、体外直接转录目的RNA作为诱饵，避免了RNA互补探针导致的非特异性结果；

3、质谱鉴定具有高效、通量大的特点，可一次性获得可能与目的RNA互作的蛋白。

RNA Pull-down的缺点：

1、受磁珠的影响，不同的磁珠会产生不同的实验结果；

2、实验成本较高，应用范围有限；

3、只能检测到蛋白和RNA结合，不能检测到RNA和其他物质结合，不能用来研究RNA的功能性相互作用。

参考文献

Aranda S, E Borràs, E Sabidó, et al. Chromatin-Bound Proteome Profiling by Genome Capture[J]. STAR Protocols, 2020:100014.

Carmichael, Gordon G. [Methods in Molecular Biology] Regulatory Non-Coding RNAs Volume 1206 RNA Pulldown Protocol for In Vitro Detection and Identification of RNA-Associated Proteins[J]. 2015, 10.1007/978-1-4939-1369-5(Chapter 8):87-95.

Smith D B, Johnson K S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase[J]. Gene, 1988, 67(1):31-40.