大肠杆菌菌液 PCR

将菌体热解释放的 DNA 质粒为模板直接用于 PCR 反应扩增，鉴定目的片段。

检验目的片段是否成功插入载体质粒。

菌液

GoTaq® Green Master Mix（PCR 预混酶溶液、M7122、promega）或其他常规 PCR 试剂盒

无酶水、无菌枪头

目的片段扩增引物（或通用引物）

无菌无核酸酶的离心管

含固体培养基的平板、液体培养基

载体对应的抗生素

进行大肠杆菌菌液 PCR 的操作流程如下：

1、挑菌扩培：在超净工作台中，利用 10 μl 枪头挑取单克隆放入 300 μl 含相应抗性的液体培养基中，在摇床上 37 ℃，220 rpm 培养 3~4 小时即可取菌液进行 PCR；

2、将 GoTaq® Green Master Mix 从冰箱取出，混匀后瞬离，也可使用其他常规 PCR 试剂盒，按照说明书配制反应体系；

3、以下以 GoTaq® Green Master Mix 为例，按照下列表格配置 PCR 体系，同时需要设置阴性对照，阴性对照中的菌液换成无酶水。

4、将 PCR 管放入仪器进行 PCR 循环反应。

5、反应结束后，取 PCR 反应产物进行 1%~1.5% 琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下观察并拍照，根据目的条带大小取阳性菌落送测序，测序结果比对目的条带序列以鉴定是否构建成功。

1、在正式实验前，可以拿确定可行的质粒或者菌液样本进行预实验，探究最适 Tm 值和引物的效果。

2、进行菌液 PCR 时最好设置一个阴性对照，必要时设置阳性对照组（control），如果实验组没有出现条带或者条带位置不对，可以通过阴性和阳性对照组分析结果形成的原因，不必进行盲目重复实验来寻找原因。

问题思考方向：PCR 体系配置有问题，PCR 程序设置有问题，上下游引物不匹配或者是基因片段没有连到载体上等等。

3、菌液量不要过多或过少。PCR 是一个很灵敏的反应，微量的 DNA 模板都可以通过扩增得到目的条带。菌液是一个很复杂的溶液，里面含有培养基及各种细菌代谢产物，这些物质的量过多会影响甚至抑制酶的活力。如果觉得加入 0.2 μl 的菌液量不好吸取，可以将 1 μl 菌液稀释 10 倍后再取 0.5~1 μl 加入 PCR 体系。