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PCR技术

乳酸菌菌液 PCR

2024-05-13 PCR技术 加入收藏
一、简介不必提取目的基因 DNA,不必酶切鉴定,直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增与鉴定。 二、用途常用于检测菌落是否携带目标质粒。材料与

一、简介

不必提取目的基因 DNA,不必酶切鉴定,直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR 扩增与鉴定。


 二、用途

常用于检测菌落是否携带目标质粒。

材料与仪器

MRS 固体培养基、MRS 液体培养基、2 × Taq Mix 等 PCR 所需试剂、目标菌株特意基因引物、ddH2O

步骤

(1)菌种的分离和纯化:采用 MRS 培养基对样品平板划线法进行分离培养,培养后挑选单个菌落在 MRS 固体培养基上进行反复多次划线培养,镜检直至看到单形态的纯菌种。

(2)实验前准备:从 MRS 固体平板上挑取单菌落,重悬于 300 μL MRS 液体培养基中,于 37 ℃,180 r/min 摇床上培养 3~4 h。

(3)加样:根据 Taq 酶试剂说明,在冰上配置 PCR 体系,向 PCR 中分别加入去离子水、2 × Taq Mix、引物。接来下操作置于超净台上,在超净台中最后加入菌液模板。反应体系(25 μL)为:2 × Taq Mix 12.5 μL,正反向引物(10 μmol/L)各 0.5 μL,菌液 2 μL,ddH2O 9.5 μL。同时设置阴性对照,阴性对照中模板为灭菌 ddH2O。

(4)PCR 反应:将含有 PCR 反应液的 PCR 管放入 PCR 仪中,根据酶的使用说明,设置反应条件,进行 PCR 反应。常规反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s;56 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min;35 个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 保温。反应结束后,将 PCR 产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像仪观察目的条带并拍照。

(5)测序:将符合目的条带大小的结果阳性的菌液送去测序,确定目标序列的存在和鉴定乳酸菌类型。

注意事项

(1)挑菌:加菌液模板时需在超净台中进行,防止挑取的单菌落污染其他杂菌。

(2)PCR 加样操作:EP 管和枪头等耗材要先进行高压蒸汽灭菌,去除 DNA 酶(无酶无菌耗材除外)。

(3)PCR 反应体系:反应体系的组成必须准确无误,反应体系中的每种组分的浓度必须严格控制,避免产生不必要的影响。

(4)引物设计:引物的设计必须准确无误,避免引物的特异性不足或者引物的二聚体形成导致的扩增效率低下。

(5)PCR 反应条件:PCR 反应条件包括温度、时间、酶浓度等,需要严格控制以确保 PCR 反应的准确性和稳定性。

(6)PCR 反应质量控制:PCR 反应后,需要进行质量控制,如电泳检测 PCR 产物的大小和数量,确保 PCR 反应结果的准确性和可靠性。

常见问题

(1)出现非特异性放大:可能是 PCR 反应体系中反应条件不合适,如温度、时间、酶浓度等。也可能是引物设计不合理,需要重新设计引物。

(2)PCR 反应无放大:可能是样品中的 DNA 浓度过低,需要提高 DNA 的浓度,可通过延长菌液培养时间或增加菌液模板量解决。也可能是 PCR 反应体系中反应条件不合适,需要重新调整反应条件。

(3)PCR 产物不稳定:可能是 PCR 反应体系中存在抑制因素,如杂质或其他抑制因子,需要对反应体系进行优化。

(5)PCR 重复性差:可能是样品处理、反应体系或 PCR 仪器本身的问题,需要检查并解决问题。

(6)扩增产物出现多条带:可能是挑取单菌落的时候沾到多个菌,或者是反应过程中污染了外源 DNA,需要注意严格挑取单菌落,和反应过程中的无菌操作。



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