基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成法

基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成的方法（PCR-based accurate synthesis， PAS）相对简便（只需要 2 步 PCR）、快速、准确（每合成 1 000 bp 错配 ≤ 1）和廉价，已经成功合成了大量的基因，包括含高（G + C）含量、重复序列和复杂的二级结构的基因。

Xiong 等人应用 PAS 法合成了枯草芽弛杆菌次次操纵子的一个 12 kb 的 DNA 片段。运用 PAS 法设计合成 DNA 序列可以优化密码子和（G + C）含量，将不需要的限制性内切酶位点和二级结构移开。

基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成法的基本原理是。根据目的 DNA 序列，设计并化学合成与相邻的核苷酸有 21 bp 重叠的长 60 bp 的寡核苷酸。为了降低化学合成中的错误，所有的寡核苷酸应该用 PAGE 进行纯化。一组 12 个彼此相邻的 60 bp 的寡核苷酸通过 PCR 合成 400~500 bp 长度的 DNA 片段【图 6-5 （a）】；大多数的 5' 正向寡核苷酸和 3' 反向寡核苷酸（外部寡核苷酸）以保留的 10 个内部寡核背酸作为模板，采用高保真的 DNA 聚合酶（比如 Pfu，每 1 000 bp 小于 1 个错误）。

由于这 2 个外部寡核苷酸的浓度是内部寡核苷酸的 20 倍，大多数的 PCR 产物应该是大约 400~500 bp 的 DNA 片段。第二步 PCR 时，应用第一步 PCR 合成的所有 400~500 bp 的 DNA 片段作为模板，合成全长 DNA 序列【图 6-5（b）】。在这步 PCR 中，应该使用产生长的准确的 DNA 片段的 DNA 聚合酶 （例如，焦硼酸钠 DNA 聚合酶，能够合成达到 10 kb 长的片段，具有与 Pfu 相似的低错误率）。最后，通过 DNA 序列分析鉴定合成的基因序列，用重叠延伸 PCR 技术校正序列中的误差。

器材：

① EP 管；

② PCR (GeneAmp PCR System 9600)；

③ ABI PRISM 310 生物分析仪等。

试剂：

① BigDye Terminator v3.1 循环测序法试剂盒；

② 寡核苷酸混合物。

基于 PCR 的长 DNA 序列准确合成法的基本过程可分为如下几步：

一、第一步 PCR 400~500 bp DNA 片段的合成

1、将一组 12 个彼此相邻的 60 bp 的寡核苷酸合成一个 400~500 bp 的 DNA 片段（图 6-5）。在整个过程中，所有的反应试剂应该贮存和在冰上处理。如长为 2 766 bp 的 PULA 基因，所有合成的寡核苷酸被分成 6 组，合成每个 DNA 片段［见图 6-5（a）］。

2、对于每个组，将 10 个内部引物混合：每个引物取 1 μL（30/μmol/L）加入到一个 EP 管里，轻轻混匀。阳性对照为「已知模板」，其中有 10 个内部寡核甘酸被替换为全长基因的适当序列的；阴性对照为「无模板」，即用水代替了内部寡核苷酸；同时，采用加入每对外部引物中的一个引物即「单个引物」作为阴性对照。以 PULA 基因为例，管 A1，A2，A3，A4，A5 和 A6 自包含了相应的 10 个内部寡核苷酸。

3、取出寡核苷酸混合物 0.5 μL 加入到 500 μL 的 PCR 离心管中。如 PULA 基因，从管 A1，A2，A3，A4，A5 和 A6 里取出 0.5 μL 到相应的管 B1，B2，B3，B4，B5 和 B6［图 6-5（a）］。

4、加入每对外部引物（30 pmol）1 μL，每管包含合成一个 400~500 bp 的 DNA 片段的所有的 12 个寡核苷酸。

5、然后在每个管里（包含总量 2.5 μL 的 12 个寡核甘酸混合物）加入下面的 PCR 反应物：

将内容物在管里轻弹混合并离心。

6、在下列条件下进行 PCR（GeneAmp PCR System 9 600）：

7、从每管 PCR 产物取出 10%（5 μL）进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳，150 V，20 min；对 PCR 产物进行定量，从第一步 PCR 得到的单链 DNA 产物至少 100~200 ng， 以确保从第二步 PCR 得到高质量的产物。在第一步 PCR 看到有多重条带时，靶基因应进行凝胶纯化。为了合成长 DNA 序列（例如，4 kb），在收集全长 DNA 前先合成 2 kb 的中间产物，克隆和测定这些中间物，并对它们进行误差校正后再继续下步实验。

二、第二步 PCR 装配全长 DNA 序列

8、对第 7 步的所有 PCR 产物，从每个产物取 1 列（相当于 50 ng DNA）混合到 500 μL 的 EP 管里（图 6-5）。注意事项：从第一步 PCR 的每个产物里取出大约相等的量加入，以获得高质量的全长 DNA 进行第二步 PCR。

9、然后取出 1 μL 混合物加入到一个 500 μL 的 PCR 管里。

10、加入全长 DNA 的最外部的 2 个引物（30 pmol），如 PULA 基因，加入寡核苷酸 1 和寡核苷酸 71［图 5-6（b）］。同时加入以下 PCR 反应物进行 PCR：

11、PCR（GeneAmp PCR System 9 600）条件为：以「已知模板」作为阳性对照，即以全长基因代替第一步 PCR 得到的 DNA 片段作为模板；「无模板」即用水代替做模板和「单引物」作为阴性对照。

12、将得到的全部 PCR 产物在 1.0% 的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，电压 150 V， 时间 20 min， 进行凝胶纯化。应该获得大小正确的一条干净、单一的条带。第二步 PCR 得到的 DNA 片段产物应该进行凝胶分离纯化，以使后面的克隆更加容易进行。注意事项：应对合成产物的准确度进行验证及错误校正。

13、对得到的 PCR 产物克隆到任何的载体里，进行 DNA 序列分析。注意事项：焦硼酸钠聚合酶得到的 PCR 产物为平头末端，如果使用的是 TA PCR 克隆试剂盒，那么必须加入 3'-氨基嘌呤。

14、为了保证合成的 DNA 不存在错误，使用 BigDye Terminator v3.1 循环测序法试剂盒和 ABI PRISM 310 生物分析仪进行测序。对于有害的错误，可以利用 OE-PCR 校正［以 PULA 基因为例，见图 6-6（a）］。PAS 终产物的错误主要有两个原因：化学合成寡核苷酸时的错误和从 PCR 造成的产物错误。当前用来合成寡核苷酸的方法，尤其是利用多频合成器进行长寡核苷酸高通量的合成时，常常会引起序列过早终止或者内部缺失。如果使用未纯化的寡核苷酸，错误率将高达每合成 1 000 bp 有 5~10 个错误。而使用 PAGE 纯化的寡核苷酸，错误率将降低到每合成 1 000 bp 约有 1 个。因此，用 PAGE 纯化寡核苷酸是很必要的。虽然使用 PAGE 纯化可以去除不正确长度的寡核苷酸，但是无法检测并去除碱基置换的错误。

三、OE-PCR 验证

15、为了能够校正每个错误，在反应方案里设计一对精确的补充引物。例如在合成 PULA 基因中，发现了 3 个错误：A 589 G， C 1320 T 和 T 2120 A ［图 6-6（a）]。因此化学合成 6 个 DNA 序列正确的新寡核苷酸（长度为 25 bp）覆盖三个有错误的部分。这 6 个寡核苷酸命名为 PULA-M1， PULA-M2， PULA-M3， PULA-M4，PULA-M5 和 PULA-M6［图 6-6（b）］。每对寡核苷酸覆盖一个错误的区域。比如，寡核苷酸 PULA-M1 和 PULA-M2 覆盖了包含错误 A 589 G 的区域［图 6-6（a）］。简短地说，OE-PCR 的第一步使用 PCR 合成的 DNA 片段Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和 IV［图 6-6（a）］，利用 PAS 方法生产的 PULA DNA 序列作为模板。DNA 片段Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和 IV 应该已校正了 3 个错误。第二步以混合的 DNA 片段Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和 IV 作为模板，PCR 合成完整的 PULA 基因。

16、对 PCR 管进行编号，每个管里加入 100 ng 第二次 PCR 合成的全长 DNA。加入 1 μL（30 pmol）适当的上下游引物到相应的管里。例如 PULA 的合成，对于管 Ⅰ，加入 PULA-1 和 PU- LA-M2［图 6-6（b）］扩增 DNA 片段 Ⅰ［图 6-6（a）］。对于管Ⅱ，加入 PULA-M1 和 PULA-M4［图 6-6（b）］扩增 DNA 片段Ⅱ［图 6-6（a）］。对于管Ⅲ，加入 PULA-M3 和 PULA-M6［图 6-6（b）］扩增 DNA 片段Ⅲ［图 6-6（a）］。对于管 IV，加入 PULA-M5 和 PULA-71［图 6-6（b）］扩增 DNA 片段 IV［图 6-6（a）］。

PCR 的条件如下：

17、通过 PAGE 纯化 PCR 产物。

18、混合 PAGE 纯化的 DNA 片段（每个片段 100 ng）。取 1 μL 从第 ⑩ 步得到的每对最外部寡核苷酸作为引物合成全长 DNA（GeneAmp PCR System 9 600）。进行 PCR，条件如下：

19、将得到的全部 PCR 产物在 1.0% 的琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，电压 150 V， 时间 20 min。观察是否得到预期的单一条带，然后进行基因测序。