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PCR技术

基于 PCR 的 DNA 斑点印迹实验

PCR
2024-05-16 PCR技术 加入收藏
原理dNTP ,PCR 缓冲液,聚合酶混合液,嵌套引物,LB-氨苄液体培养基,溶液NaOH,SSC,Tris-HCl,PCR 产物微量滴定板,尼龙膜,紫外交联装

原理

dNTP ,PCR 缓冲液,聚合酶混合液,嵌套引物,LB-氨苄液体培养基,溶液NaOH,SSC,Tris-HCl,PCR 产物
微量滴定板,尼龙膜,紫外交联装置,96 孔或 384 孔复制器,热循环仪,PCR 管或反应板

材料与仪器

dNTP PCR 缓冲液 聚合酶混合液 嵌套引物 LB-氨苄液体培养基 溶液NaOH SSC Tris-HCl PCR 产物
微量滴定板 尼龙膜 紫外交联装置 96 孔或 384 孔复制器 热循环仪 PCR 管或反应板

步骤

第 1 阶段:通过 PCR 扩增 DNA 插入片段

一、材料


1. 缓冲液、溶液和试剂

dNTP 溶液(包含所有 4 种 dNTP, 每种为 10 mmol/L)

2. 酶和酶缓冲液

10XPCR 缓冲液(40 mmol/LTricine-KOH、22°C 下 pH9.2,3.5 mmol/L 乙酸镁,10 mmol/L 乙酸钾,75 mg/mlBSA, 或者厂商提供)

聚合酶混合液,50X(Advantage2,Clontech,或相当产品)

3. 核酸和寡核苷酸

嵌套引物 NPundefined

嵌套引物 NP2undefined

~undefined或者,载体上插入位点两侧的引物也可以用来进行 PCR 扩增插入片段。

4. 培养基

LB-氨苄液体培养基

配制 1L 培养基,在 950 ml 无离子水中溶解 10 g 细菌用胰蛋白胨、5 g 细菌用酵母提取物、10 gNaCl,用 5mol/LNaOH 调节 pH 到 7.0。用无离子水将体积补到 1L。在 151bf/in2(llbf/in2=6894.76Pa)下高压灭菌 20 min。髙压灭菌后的培养基冷却后,加入氨苄西林,使终浓度为 50ug/ml。

5. 专用设备

热循环仪

在这一阶段,PCR 在板子上进行,而且不得要以前的精确度,因而没有必要使用矿物油。

PCR 管或反应板

6. 附加试剂

琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

7. 细胞和组织

cDNA 文库,存在于合适的菌株中,以菌落的形式生长在 LB 琼脂平板上

二、方法

1. 从文库中随机挑取 96 个或 384 个白色的细菌菌落。

2. 在一个 PCR 板上,每个菌落用 150ulLB-氨苄培养基 37°C 下轻轻振荡培养,时间至少为 4 h(或过夜)。

3. 配制用于 100 个或 400 个 PCR 的主体混合液。



4. 将 19ul 主体混合液分装到每个管子或反应板的每个孔中。

5. 从每个细菌培养液(见上面第 2 步)中,各取 1ul, 加到装有主体混合液的各 PCR 管或 PCR 板的各个孔中。

6. 用下面的条件,不使用矿物油在热循环仪中进行 PCR。



7. 从每个反应中各取 4ul 在 2% 琼脂糖凝胶上分析。

第 2 阶段:斑点印迹分析

一、材料


1. 缓冲液、溶液和试剂

0.6mol/LNaOH(新鲜配制,或从浓的储存液中新稀释)

SSC,20X(1L 配方:175.3 gNaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠,pH7.0)

0.5mol/LTris-HCl,pH7.5

2. 核酸和寡核苷酸

PCR 产物

3. 专用设备

微量滴定板

尼龙膜

紫外交联装置(比如 Stratagene 的 UVStratalinker),或 68°C 烘箱

96 孔或 384 孔复制器

二、方法

1.从每个 PCR 产物中,各取 5ul, 与 5ul 0.6mol/LNaOH 混合。

2.从每个混合液中,各取 1~2ul 到尼龙膜上。这一步可以使用 96 孔或 384 孔复制器在用作 PCR 扩增的微滴定板相应的孔中蘸一下,再点到一块干的尼龙膜上。至少点 2 张同样的膜,分别用来与正向和反向消减探针进行杂交(方案 1 第 3 阶段)。强烈推荐点 4 张相同的尼龙膜。2 张与正向和反向的消减 DNA 进行杂交,另外 2 张与最初的 cDNA 或基因组 DNA 进行杂交。

3.用0.5mol/LTris-HCl(pH7.5) 中和 2~4 min, 并用 2XSSC 洗涤。

4.用紫外交联装置(比如 Stratagene 的 UVStratalinker) 将 DNA 固定在膜上,68°C 烘烤 4 h。


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