多重 PCR

多重 PCR (multiplex polymerase chain reaction, MPCR) 也称复合 PCR，是在常规 PCR 基 础上改进并发展起来的一种新型 PCR 扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对以上引物，同 时扩增出多个核酸片段，由 Chambehian 于 1988 年首次提出，其反应原理、反应试剂和操作过 程与常规 PCR 相同。多重 PCR 既有单个 PCR 的特异性和敏感性，又较之快捷和经济，在引物和 PCR 反应条件的设计方面表现出很大的灵活性。多重 PCR 还能提供内部对照，指示模板的相对 数量和质量。

多重 PCR 基本原理与常规 PCR 相同，区别是在同一个反应体系中加入一对以上的引物，如存在与各对引物互补的模板，则它们分别结合在模板相对应的部位，同时在同一反应体系中扩 增出一条以上的目的 DNA 片段。多重 PCR 反应体系的组成和 PCR 循环的条件需要经过优化以 确保同时扩增几个片段"理论上只要 PCR 扩增的条件合适，引物对的数量可以不限，但由于各 种条件的限制，实际能够扩增的引物对数量是有限的。
PCR 结果的分析方法有以下几种，包括：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸杂 交、限制性酶切分析、核酸测序等，其中琼脂糖凝胶电泳是最简单、最快速的方法，但是与聚丙 烯酰胺凝胶电泳相比分辨率比较低。限制性酶切分析需要将 PCR 产物回收酶切后再次电泳，耗 时费力，难以推广应用以核酸测序是鉴定 PCR 产物最可靠的方法，但需要专门的测序仪器，并 且需要花费的时间也比较长。如果要将鉴定感染性疾病病原的多重 PCR 方法用于临床及现场流 行病学调査，琼脂糖凝胶电泳是最佳的选择。

多重 PCR 的常用应用领域如下：

（一）多重 PCR 在遗传病诊断方面的应用

1.DMD 和 BMD 的检测

Duchenne 型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种很常见的人类遗传 病，为 X 性染色体隐性遗传性肌肉变性疾病，50% 的病例由基因缺失引起，大约每 3500 个男婴 就有一个发病，1/3 的病例由新的突变所致。肌营养不良基因长 2000kb, 至少有 70 个外显 子，被 35 个平均 35kb 的内含子所间隔。目前尚无有效治疗的方法，因而高度准确的产前诊断和 DMD 阳性筛选是十分重要的。以往多用 Southern 分析技术来诊断，但由于该基因由多达 70 个外显子，至少需要 7〜9 个 cDNA 克隆才能诊断，费用高、费时而难以常规开展。BMD 是 Becker 型肌营养不良症（Becker muscular dystrophy）的缩写。BMD 亦为 X 性染色体隐形遗传性 肌肉变性疾病。BMD 的发病率为新生男婴的三万分之一。65% 的 BMD 病例的原因是基因 缺失。
Chamberlain 等利用多重 PCR 技术对 DMD 进行了检测，设计了 6 对外显子引物。用 1μmol/L 引物加 10U Taq 酶，延伸温度为 72C 3 min, 25 个循环。产物电泳后，如与正常对照的 对应条带相比有缺失或移位，即为异常。随后该实验室又将引物增加至 9 对，使至少 80% 的 DMD 基因缺失得到确定，能直接诊断 50% 以上的病例。Hentemann 等设计了 2 对产物分别为 140bp 和 73bp 的引物，对 42 例病人检测后，发现 7 例基因缺失并经 Southern 杂交分析证实。Simard 等如报道用 Chamberlain 的引物对 DMD 进行扩增，并对 DNA 模板处理进行了改进，用 1 ml 羊膜液离心后的细胞经非离子去垢剂和蛋白酶 K 的 PCR 缓冲液裂解后直接 PCR 扩增，效果 令人满意。由于 DMD/BMD 是等位基因，近来的文献多同时检测此两种疾病。Beggs 等用多 重 PCR 同时检测肌营养不良基因的 8 个外显子和启动子，可使 98% 有基因缺失的 DMD/BMD 获 得诊断。Covone 等人用两种方法对照研究了 127 例 DMD/BMD： 一种方法是用与 DMD cDNA 相关的 9 种 cDNA 探针与 HindJH 消化的基因族 DNA 杂交，另一种方法是用 9 对 DMD 外显子的 引物进行多重 PCR 检测，结果 73 例（57%）存在基因缺失，两组方法结果相近。我国华西医科 大学的学者亦用 Chamberlain 的 9 对引物对 17 例 DMD/BMD 病例进行了检测，结果 8 例（47%）发现基因缺失，证明了针对西方人的引物序列同样可以检测中国病例。

2. 用于其它遗传病的检测

Picci 等人已对囊性纤维化 (cystic fibrosis, CF) 基因突变进行了筛选研究，用 4 对外显子 引物进行多重 PCR 扩增，然后用限制性内切酶消化 PCR 产物，再进行垂直聚丙烯酰胺凝胶电 泳, 检査 15 例发现有 3 例发生了基因突变。Prior 等设计了 8 对引物同时检测 DMD/BMD 和 CF, 通过凝胶电泳筛选 DMD/BMD 缺失突变，并用等位基因特异的寡核甘酸杂交确定 CF 突变 是否存在。实验表明，可以通过多重 PCR 的方法从血斑中获得足够的 DNA 进行分子分析，可用 于新生儿的筛选。Pillers 等人用多重 PCR 和 Southern 杂交方法研究了一位同时患 AIED (Aland island eye disease) 甘油激酶缺乏 (GKD) 和 DMD 的病例，发现在 DXS67 (l-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase 67) 和 DMD 基因之间出现基因缺失。另外，还有用多重 PCR 方法筛 査类固醇硫酯酶 (steroid sulfatase, STS) 缺乏症和诊断日地中海贫血患者的报道。

脊髓性肌萎缩症 (spinal muscular atrophy, SMA) 是一种常染色体隐性遗传神经性肌肉疾 病。SMA 会造成位于脑底和脊髓的下级运动神经元分裂，从而使其无法发出肌肉进行正常活动 所依赖的化学及电信号。SMA 主要影响患者的近端肌，即最靠近人体躯干部的肌肉。控制胃、 肠和膀胱等器官运动的非随意肌不会受到影响。各型都会对控制随意肌运动的叫作运动神经元的 神经细胞产生影响。最近的基因研究发现，运动神经元的死亡也许是因为缺少一种或几种蛋白， 或者是它们不能完全发挥其功能而导致的。Simard 等网应用多重实时反转录 PCR 方法 (multiplex real-time reverse transcriptase-PCR) 对存活运动神经元 (survival motor neuron, SMN) 的 转录本进行定量，共检测了 42 个潜伏期 SMA 病人的血标本，每个病人取三个时间点，发现 SMN 的表达在每个病人的不同时间点上的转录是稳定的，SMN mRNA 表达的实时定量检测可 以作为 SMA 临床试验的生物标志。

甘露糖结合素 (m&nnosobinding lectin, MBL) 是一种血清蛋白，能够触发补体激活，因此 在先天性免疫中发挥重要作用。低水平的 MBL 会损伤病原微生物的调理作用，进而导致儿童的 反复感染、免疫受损病人的严重感染以及自身免疫疾病。MBL 的编码基因位于人类 10q11.2〜q21 染色体，包括四个外显子，血清中 MBL 水平受其启动子多态性和基因第一 个外显子突变的影响。目前应用的 MBL 基因分型方法主要有以下几种：PCR-限制酶切分析、序 列特异寡核昔酸探针杂交 (sequence_specific oligonucleotide probes, SSOP)、放大受阻突变体系 (amplification refractory mutation system, ARMS)、ARMS 联合 SSOP、异源双链分析 (hetero duplex analysis)。实时 PCR 以及应用小沟结合 DNA 探针的 5』端核酸酶分析。Helena 等建立了 一种快速、高效的多重 PCR 方法对 MBL2 基因进行分型，并且将捷克人作为斯拉夫人的代表样 本，应用此方法研究了 MBL2 的等位基因频率。共分析了 359 个不相关捷克人的 MBL2 基因， 最终得出 LYD 单元型在斯拉夫人的祖先中比其它高加索人更常见，同时也证明了多重 PCR 是一 种比传统 PCR 方法更快速、简便、省时省力的 MBL2 分型方法。

根据当前不育领域的研究，大约 10％〜15% 的夫妇存在不育的问题，而在所有的不育个体 中，男性不育大约占 50%, 其中 40%〜50% 存在精子缺陷，如少精症和无精症。 人类 Y 染 色体的长臂对于精子的产生是必需的。在三个不同区域的缺失会导致严重的精子缺陷，包括非闭 塞的无精子症和精子减少症。这些区域被称为无精子症因子 (azoospermia factor, AZF)，三个 分离的非重叠区被定义为 AZFa、AZFb、AZFc, 与产生人类损伤的精子有关。近来的研究证明 Yq 染色体的微缺失会遗传给其儿子。Yeom 等应用多重 PCR 扩增 6 个位点，包括 Y 染色体 的性别决定区 (sex-determining region on the Y chromosome, SRY) 作为阳性对照，无精子症因 子区域的 5 个序列标签位点 (sequenc-tagged site, STS), 其中模板是从不育男性血液中提取的 基因组 DNA。本研究中的引物为 Cy3 标记，PCR 产物可以与固定的探针杂交，提供了一种敏 感、高通量检测 Y 染色体缺失的方法，也是一种男性不育筛选的新方法。

(二) 着床前胚胎遗传学诊断 (preimplantation genetic diagnosis, PGD)

PGD 产生于 10 多年前，主要目的是识别基因突变或染色体错误引起的遗传性疾病。临床上 最早是用来检测夫妻 X 隐形连锁疾病，随后应用于不同的患者来达到优生优育的目的，主要包单基因病携带者，无论显性或隐性、常染色体或 X 连锁；染色体结构异常携带者，包括易 位、翻转、缺失、插入等；避免高龄产妇后代染色体异常；辅助生殖治疗反复植入失败的夫妇； 反复出现不明原因流产的夫妇。当前 PGD 已经成为产前诊断 (prenatal diagnosis) 的一种替代 方法。

对于单基因缺陷患者，可以用多重 PCR 同时扩增多个位点，选择那些位于相同染色体或者 临近致病基因的多态性标志位点进行扩增能够有效诊断突变位点和多态性等位基因，可以同 时分析多个诊断位点，并且减少错误诊断的概率。另外，还可以扩增高变的指纹位点，指示 DNA 模板是否被污染。

囊性纤维化病 (cystic fibrosis, CF) 是一种首次成功应用单细胞植入前基因诊断的单基因缺 陷性疾病。CF 的突变谱差别很大，因此，发展一种突变特异的 PGD 方法是行不通的。文献建立了一种针对 CF 通用的多重 PCR 方法，用于胚胎的遗传学诊断。本研究应用了 CF 跨膜调控子 (cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR) 两侧的 4 个紧密连锁高多态性重复标识：D7S523、D7S486, D7S480 和 D7S490。共检测了 100 个白细胞和 50 个卵裂球，其中 99% 获得了多重 PCR 结果，总体等位基因遗失 (allelic ｄｒｏｐ out , ADO) 频率从 2%〜5% 不等。确认 ADO 以及额外等位基因存在后，95% 的多重 PCR 结果可以用来建立基因型标记。基于父母的基 因型，考虑到由于变异参数 (5%)、ADO (0〜2%) 和单重组 (1.1%〜3%) 造成的胚胎传送 丢失，大约 90% 的胚胎能够应用单个卵裂球进行可靠的 PGD 基因分型。错误诊断的概率与已知 的两侧标识双重组概率相当，小于 0.05%。因此，这种多态性和多等位基因标识系统是一种可 靠的、可替代直接突变胚胎遗传学诊断的方法。

(七) 在遗传修饰生物 (genetically modified organisms, GMO) 中的应用

近年来可见应用多重 PCR 技术在转基因成分定性和定量检测的报道。陈文炳等用多重 PCR 方法在反应体系中加入 13 对引物同时检测转基因矮牵牛与阳性对照质粒中的 1〜3 个外源基 因，包括花椰菜花叶病毒 (cauliflower mosaic virus, CaMV) 35S 启动子、根瘤农杆菌胭脂碱合 成酶基因终止子 (NOS)、大肠杆菌 K12 菌株新霉素磷酸转移酶 U (NptH) 编码基因。结果表 明，多重 PCR 不但可以提高检测效率、降低检测成本，还可以有效防止假阳性结果的出现。

(八) 基因重排

免疫球蛋白 (immunoglobulin, Ig) 和 T 细胞受体 (T cell recetptor, TCR) 位点包含很多不 同的 V、D、J 基因片段，参与早期白细胞分化的重排过程。V-D-J 片段重排由重组酶复合体介 导，其中 RAG1 和 RAG2 蛋白通过识别、切割 DNA 重组信号序列 (recombination signal sequences, RSS) 发挥重要作用，RSS 位于 V 基因下游、D 基因两端和 J 基因上游。不合适的 RSS 会降低甚至完全阻止重排。van Dongen 等成功建立了一种多重 PCR 方法并将其标准化，能够 检测同源细胞重排免疫球蛋白和 T 细胞受体基因、染色体畸变 t (11； 14) 和 t (14； 18)。在 18 个多重 PCR 反应中，可以使用 107 对不同的引物进行扩增。14 个 Ig/TCR 和 4 个 BCL1/BCL2 多 重反应体系证明了多重 PCR 反应完全适合淋巴增生缺陷的克隆研究，并且具有较高的敏感性。 特别是在疑似 B 细胞增殖中与 IGH 和 IGK 联合应用，疑似 T 细胞增殖中与 TCRB 和 TCRG 联合 应用具有极高的克隆检出率。

(九) 抗性基因检测

抗生素的广泛使用导致具有耐药性微生物的增多，比如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methi- cillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 万古霉素抗性肠球菌 (vancomycin resistant en - terococci) 和多重耐药结核分枝杆菌 (multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis) 等。这些 病原的快速检测及对应的抗生素抗性快速检测对于隔离病人和阻止疾病的进一步蔓延是很重要 的。多重 PCR 方法能够对这些抗生素抗性基因进行同时检测，节省时间，具有较高的敏感性和 特异性。

Strommenger 等应用多重 PCR 方法同时检测金黄色葡萄球菌的 9 种耐药基因，包括 mecAy aacA〜aphD、tetK、tetM、ermA、ermC、vatA、vatB 和 vatC， 并且在反应中加入另外 一对引物，扩增金黄色葡萄球菌的 16S rRNA 作为阳性对照。通过对分离的 30 株金黄色葡萄球 菌进行检测，多重 PCR 结果与肉汤微量稀释实验得到的抗性表型一致，证明了多重 PCR 是一种 识别抗生素抗性的快速、简便、精确方法，并且可以用于临床诊断、流行病学研究中用于监测抗 性基因的传播。

还可用多重 PCR 方法同时检测质粒介导的喳诺酮抗性基因 qnrA、qnrB 和 qnrS，并用来筛 选科威特分离的 64 株产超广谱步内酰胺酶 (expanded-spectrum beta-lactamase, ESBL) 的肠细菌。

(十) 微生物检测

多重 PCR 作为一种分子检测、分型方法基本上可以用于所有的微生物，但只有用于检测难 培养或不可培养微生物方面才能充分发挥其优势。
多重 PCR 可以根据需要选择不同的引物，扩增不同的目的片段。而这些扩增模板组合的选 择一般遵循以下原则：同一微生物的不同基因 (以减少假阳性结果的出现)；同属不同种的微生 物，主要用于微生物的分子分型；混合的微生物，包括一些引起相同或相似症状的微生物，拥有 相同生活环境的微生物，还有一些人为放在一起的微生物，如战伤细菌组合。

1. 检测一种微生物 (检测毒力相关基因)

金黄色葡萄球菌主要产生肠毒素 (staphylococcal enterotoxins, SE)、毒素休克症毒素 (toxic shock syndrome toxin, TSST)、脱落毒素 (exfoliative toxins) A 和瓦 Lovseth 等见用多重 PCR 方法检测金黄色葡萄球菌的 9 个肠毒素基因一 sae, seb, sec, sdl, see, seg, seh, sei 和 sej， 以及毒素休克综合征毒素 (toxic shock syndrome toxin, TSST)、16sRNA 基因，通过对多重 PCR 进行优化，能够对 9 种毒素进行正确区分。

猪链球菌是一种能引起小猪脑膜炎、关节炎、心囊炎、肺炎的病原体，多发于 3〜12 周猪 龄，特别是刚断奶的幼猪。猪链球菌在全世界范围内广泛分布，并且造成猪肉产量的损失。由于 缺乏有效的疫苗和敏感的诊断方法，猪链球菌感染一直很难得到控制。迄今为止，根据荚膜抗原 的不同，共发现 35 个血清型，其中 1/2、1、2、7、9 和 14 最为常见。然而，扁桃体可以被非产 毒猪链球菌和其它链球菌感染，仅仅依靠菌落形态很难进行区分。为了弥补这一缺陷，发展了选 择性培养基的血清型特异分离技术和免疫磁珠技术。然而，迄今为止只应用于血清型 2 和血清型 1/2 的分型。另外，这些方法费时费力，并且敏感性低。PCR 方法可以方便、特异地对猪链球菌 的毒力相关表型和特异血清型进行区分，而在此基础上的多重 PCR 方法更减少了 PCR 反应的数 量。Wisselink 等建立了两个多重 PCR 反应体系，可以用 96 孔板进行操作，能够对猪扁桃腺 标本中猪链球菌的 6 种主要血清型和两种毒力相关表型进行检测。
Guo X 等应用多重 PCR 方法从临床分离的菌株中检测肠出血性大肠杆菌 (enterohemor- rhagic escherichia coli, EHEC) O157 : H7 的毒素相关基因，包括志贺样毒素基因 (shiga-like toxin, sit)slt1 和 slt2、eaeA 和溶血素 (hly) 基因，共检测了 85 株 O157 : H7, 毒力基因检出 率为 56. 5% (48/85), 其中 79.2% (38/48) 含有 slt2、eaeA 和溶血素 (hly)，16.6% (8/48) 携带所有 4 种基因，4.2% (2/48) 只有 slt2 和 hly 基因。与国外文献报道不同，slt1 具有较低的携带率。本 研究表明多重 PCR 可以作为一种简单、快速、特异、敏感的毒力基因检测方法。
2. 对微生物进行分型

（1）同种微生物分型： 由于微生物在种水平以下还有亚种、株的分类，虽然各型细菌之间有 区别，但仅仅从表型上并不能进行区分，这就给临床诊断带来了挑战。而多重 PCR 方法作为一 种能直接针对病原基因进行分型的方法，得到了广泛的应用。

Fujioka 等建立了两个多重 PCR 反应，用来检测五类致腹泻大肠杆菌 (diarrheagenic Escherichia coli, DEC) 的 9 个毒力相关靶标基因。反应 1 包括 5 对引物：stxl、eaeA、invE, STp 和 astA；反应 2 包括 4 对引物：stx2、aggR. STh 和 LT。两个多重 PCR 反应在识别相关 菌株方面无非特异条带，显示了 100% 的特异性，从 683 株疑似大肠杆菌中检测到 51 株 DEC 和 38 株 astA 阳性菌. 本研究证明了这些方法能够降低多重 PCR 反应试剂的费用，而且对临床实验室诊断 DEC 有贡献。

（2）鉴定同属不同种的微生物：应用种特异性引物进行扩增可以对不同种的微生物进行分 型。通常选择毒力基因、降解基因、酶基因等某种菌持有的基因。

Alvarez 等建立了对沙门菌进行检测和流行病学分型的多重 PCR 方法，共涉及了 6 对引物 用来检测西班牙地区沙门菌的主要血清型和噬菌体型，另外还有一对引物用来作为内部阳性对照。将此方法用于临床粪便标本检测时，主要血清型 Enteritidis 和鼠伤寒的检测敏感性为 93%, 特异性为 100%, 有效率为 98%。PCR 反应的抑制率较低，为 8%。cohen’s kappa 指数显示，多重 PCR 与传统培养依赖的方法进行沙门菌分型的吻合率为 95%。Sharma 等建立了一种多重 PCR 方法用来检测金黄色葡萄球菌的毒素基因，将毒素基因的通用引物和毒素特异引物联合使 用，结合新的 DNA 纯化方法，可以在 3~4 h 内从纯培养物中检测肠毒素基因 A~E。用于检测 多重环境中金黄色葡糖球菌分离物，结果显示多重 PCR 方法与标准的免疫学分型方法吻合度达 99%, 并且本方法不仅可以扩增已知的毒素基因，还能用来检测具有新特点以及未知的毒素基 因。Panicker 等应用多重 PCR 检测沿岸水和贝类中的致病性弧菌，选用的基因包括：脆弱弧 菌的 vvh 和 viuB , 霍乱弧菌的 ompU、toxR 和 hlyA , 副溶血弧菌的 tlh、tdh、trh 和开放阅读框 8, 通过扩增这些基因能够确定全部致病菌株，并且可以对这三种弧菌进行分型。

（3）鉴定混合的微生物： 多重 PCR 可以在一次反应中鉴定引起相同临床症状或感染同种组 织或器官的微生物。由于不同病原微生物可以引起相同或相似的临床症状，仅仅靠临床表现难以 进行区分和鉴定。有些时候，能够通过同一传播途径进行感染的病原也需要进行同时检测，如食 源性、水源性、通过海产品传播的病原等。

①引起神经系统症状的：神经系统感染对于临床医生和微生物学家来说都是一个很难的诊 断难题。疱疹病毒感染可以导致多种临床症状，包括脑炎、脊髓炎、脑膜炎等。Bouquillon 等建立的多重 PCR 方法可以同时检测 6 种人疱疹病毒：单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）1 型、2 型，人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）, 水痘带状疱疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）, 非洲淋巴细胞瘤病毒（epstein-barr 病毒，EBV）, 人类疱疹病毒 6 型（human herpes virus 6）, 说明多重 PCR 是一种快速可靠的疱疹病毒感染诊断方法。Markoulatos 等建立的多重 PCR 方法可以同时检测 HSV-K HSV-2、VZV、CMV 和 EBV 等。共检测了 86 份脑脊液标本，共检测到 9 份阳性，占总标本的 10.3%, 其中 HSV-1 有 3 份，占 3.5%； VZV4 份，占 4.6%； HSC-11 份，占 1.16%； CMV1 份，占 1.16%；未检测到 EBV 阳性标本。同时检 测 5 种不同疱疹病毒的多重 PCR 方法提供了一种早期、快速、可靠的非侵入性诊断工具，用于 指导特异性的抗病毒治疗，说明多重 PCR 方法具有重要的临床价值。Casas 等如应用多重反转 录 PCR 检测了 200 例神经症状被怀疑感染了病毒的住院病人（其中具有正常免疫力的病人 156 人，免疫缺陷病人 44 人）。在 156 例免疫力正常的病人中，肠道病毒和嗜神经疱疹病毒的阳性率 为 35%（55 例），代表了无菌性脑膜炎或脑炎；在 44 例免疫缺陷病人中，阳性率为 41%（18 例），主要病原为嗜神经疱疹病毒。多重反转录 PCR 的应用广泛，并可能成为一种特别有价值的 快速、敏感的神经性疾病诊断方法。

②引起腹泻症状的： 能够导致腹泻的病原菌主要为食源性，所以检测腹泻病原的标本主要 分为两种：食物标本和粪便标本。传统的检测方法包括分离培养、生化鉴定，费时费力，需要 4〜7d 才能得到结果。

Brasher 等建立的多重 PCR 可以检测贝类中的大肠杆菌，以及鼠伤寒沙门菌、脆弱弧菌、 霍乱弧菌和副溶血弧菌，其选取的特异基因分别为 uidA、cth、invA、ctx 和 tl 基因。其中大肠 杆菌可以指示标本被粪便污染的程度，其它四种为贝类中的常见病原，优化后的多重 PCR 方法 敏感性低于 101〜102cfu, 是一种有效、敏感、快速检测贝类中微生物病原的方法。Kim JS 等分别选取了大肠杆菌 O157 ： H7、沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌和副溶血弧菌的 特异基因志贺样毒素（细胞毒素 II 型）、femA（胞质蛋白）、toxR（跨膜 DNA 结合蛋白）、iap（侵袭相关蛋白）和 invA（侵袭蛋白 A）, 实验证明这 5 种引物的特异性良好，而且能够在 24 h 内 得到检测结果。

③引起呼吸道症状的：呼吸道病毒感染诊断的传统方法是细胞培养和直接荧光抗体 (direct fluorescent antibody, DFA) 实验。多重反转录 PCR 是一种检测病毒的敏感、特异、快速方法。 Syrmis 等建立的多重反转录 PCR (m-RT-PCR) 方法用多个针对病毒的特异引物，与针对病 毒特异基因序列的酶联扩增杂交试验 (enzyme-linked amplicon hybridization assay, ELAHA) 结 合，检测了 598 份疑似呼吸道感染者鼻咽抽吸物 (nasopharyngeal aspirate, NPA) 标本，方法的 特异性为 100%。与 m-RT-PCR-ELAHA 方法相比，DFA 的敏感性为 79.7%, 培养物扩增 DFA (culture amplified-DFA, CA-DFA) 为 88.6%。用 m-RT-PCR-ELAHA 方法筛选的 598 份 NPA 样 本中，3% 为腺病毒 (adenovirus, ADV) 阳性，2% 为流感病毒 A (influenza A),0.3% 为流感 病毒 B (influenza B) , 1% 为副流感病毒 1 型 (parainfluenza type 1, PIV1) , 1% 为副流感病毒 2 型 (parainfluenza type 2, PIV2) , 5. 5% 为副流感病毒 3 型 (parainfluenza type 3, PIV3) , 21% 为 呼吸道合胞病毒 (respiratory syncyial virus, RSV) 。 与 DFA 和 CA-DFA 方法相比，m-RT-PCR- ELAHA 具有敏感、特异、快速的优点，是对临床实验室检测呼吸道病毒传统方法的重大改进， 是一种可以用于日常临床和实验室操作的方法。
Bellau-Pujol 等建立了三个多重反转录 PCR, 用来同时检测 12 种 RNA 呼吸道病毒，包括 流感病毒 A、B、C, 人类 RSV, 人变性肺病毒 (human metapneumovims, hMPV), PIV-1 2、 3、4, 人冠状病毒 OC43 和 229E, 以及鼻病毒 (rhinovirus, hRV)。与免疫荧光和病毒分离方法 相比，多重 PCR 更为敏感、快速，能够检测更多种类的呼吸道病毒。

多重 PCR 可以与其它方法结合，拓宽了其应用范围。将多重 PCR 与实时定量 PCR 结合打破 了传统的科学术语，多重实时定量 PCR (multiplex real-time PCR) 通常用于描述应用多个寡核苷酸探针区分多个扩增子的情况。由于可获得的荧光基团种类有限，导致这种方法的应用是有一 定难度的。RT-PCR 是用来扩增 RNA 的方法，与多重 PCR 结合的多重反转录 PCR 也用于扩增 RNA, 主要用于同时检测 RNA 病毒。Diaz de Arce 等建立了新的、敏感性高、特异性好的多 重反转录 PCR, 用来对古典猪瘟以及其它猪瘟病毒感染进行同时检测和分型，设计的引物针对 扩增 5'端非编码区和 NS5B 基因。

器材：PCR 热循环仪、核酸电泳仪、凝胶成像设备、离心机等。

试剂：

①高压过的超纯水（高压的目的是使其中的 DNase 失活，以免降解模板 DNA）；

②PCR 缓冲液（选用与所用聚合酶对应的缓冲液）；

③4 种 dNTP 混合物（每种 dNTP 的浓度为 2. 5 mmol/L）;

④引物（引物合成后，用超纯水稀释为 10 mmol/L）；

⑤热稳定的 DNA 聚合酶（不同厂家、不同批次的酶可能会有差异）；

⑥DNA 模板（尽量使用纯化后的核酸作为模板）。

多重 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）选择目标基因

由于多重 PCR 在同一个反应体系中需要加入多对引物，而模板直接影响扩增的结果分析, 这就导致了扩增模板的选择至关重要。同时，扩增区域的选择必须符合分析的目的，如通常对于 致病微生物，需要选择其保守序列，如 16SRNA, 或者毒力基因、毒力相关基因，以防止检测 到非致病突变体而无法解释结果；对于需要分型的对象来说，需要选择它们之间有差异的保守序 列进行扩增；对于高度同源的序列来说，可以用相同的引物进行扩增，但获得的阳性结果需要利 用特异探针杂交或限制性酶切进行进一步确定；缺失分析选择扩增外显子；法医学鉴定个体差异 选择扩增高度多态性标志；转基因检测则选择转入的动植物基因座；性别鉴定一般选择 X 或 Y 性染色体上特有的基因座。
对于含有多个外显子的基因缺失分析来说，可选择缺失热点较广区域或缺失密集区域。相邻 近的外显子可用跨越这两个外显子的引物进行扩增。

（二）引物设计

引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸序列，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。因此, 引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与灵敏度。要确定引物的位置，首先需要知道所选择的基 因引物与模板结合部位的详细 DNA 序列信息。在多重 PCR 中，为了保证扩增效率，所有的引物 对必须优化到相近的扩增条件口旳。因此，多重 PCR 的引物设计除了要满足一般 PCR 引物设计的 原则外，还要注意以下几个问题：①各引物之间不能互补，尤其避免 3』的互补，以免形成二聚体，引物设计好以后进行 PCR 扩增，以检验引物之间是否配对形成二聚体；②各引物与其它扩增片段和模板不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大的同源性；③对于引物的长度、（G+C）含量、Tm 值要求尽量一致；④各引物扩增产物的片段大小要有一定的差别，以便 于用电泳的方法进行区分。一般来说，产物片段越大，其长度的差别也应该越大。这就给多重 PCR 引物的设计带来了一定的难度。

（三）核酸提取

核酸依赖的检测方法受目标核酸纯化的影响，核酸的纯化程度决定了核酸方法的应用。多 重 PCR 的优势在于快速、系统，主要用于临床标本的检测，包括血液、组织、粪便等，同时 多重 PCR 对核酸模板的要求比较高，所以核酸的提取纯化显得尤为重要，直接与扩增结果 相关。
一般来说，通过煮沸裂解细菌制备模板可以满足普通 PCR 反应，但是用于多重 PCR 反应会 存在很多问题。在条件允许的情况下，多重 PCR 需要以纯化的 DNA 为模板，可以确保多重 PCR 的顺利进行。

（四）单位点 PCR（也叫单引物 PCR）

在进行多重 PCR 之前，必须先对每对引物进行单位点 PCRO 确定每对引物进行单位点 PCR 时条件如表 14-1 所列：

反应完成后比较扩增结果，确保在相同的循环条件下所有的引物都能扩增出对应的产物条 带，以确保引物能够特异性扩增对应的目标序列。

（五）多重 PCR（引物等浓度混合）

反应体系中各对引物等浓度混合，体系中其它各成分的浓度不变，应用与单位点 PCR 相同 的反应条件进行多位点同时扩增，根据扩增结果对多重 PCR 反应体系及反应条件进行调整。

多重 PCR 的反应体系和反应条件基本与单位点 PCR 相同，但也不能一蹴而就，必须使多重 PCR 反应中每对引物对应的靶点都能获得足够的扩增量，并且扩增产物之间的产量应该基本 相同。

影响多重 PCR 扩增效果的因素可以分为反应体系和反应条件两大类。 其中反应体系包括 引物、缓冲液、Taq DNA 聚合酶、dNTP 和 MgCL 等，反应条件包括退火温度、延伸温度、延 伸时间，循环数等。

1. 反应体系的优化

（1）引物浓度： 在多重 PCR 体系中，引物用量和扩增的目的片段长度有着正比内在关系， 即扩增片段越长，所需引物就越多，片段越短所需引物相对就越少。同时，多重 PCR 扩增中每 增加一重 PCR 扩增, 引物间相互影响就加大，这就势必影响到扩增的效果。为了降低这种不利 影响，选择适当的引物间浓度是确保多重 PCR 成功的一个关键因素。先对不同的引物进行单个 PCR 扩增，确定单个 PCR 各引物的最佳浓度，然后按照多重 PCR 的实验流程，进行两个或多个 引物对的多重 PCR 预实验。多对引物会增加 3'末端引物互补的可能性，形成引物二聚体；也有 可能发生一个扩增片段抑制另一个扩增片段的情况，这就导致了扩增结果并不是均一的。即使在优化了循环条件后，某些基因的扩增产物仍不明显。多重 PCR 反应体系优化经常可以遇到有一 个或两个靶位点的扩增产物很少甚至没有扩增产物，而其它引物的扩增效率都很好的情况。为解 决这一问题，可以通过适当地调整引物的相对浓度加以解决，增加弱条带的引物量，减少亮条带 的引物量。降低扩增效率高的引物对浓度比增加扩增效率低的引物浓度更有助于提高扩增效率低 的产物的产量。多重 PCR 反应中各引物的浓度差异一般都凭经验获得。只有在调整引物浓度达 不到要求时才考虑调整别的反应条件，例如改变反应体系中 Mg2+或 KCl 的浓度等。
有些情况，例如扩增产物是序列相似但长度不同的扩增片段，最短的产物可能扩增得更好， 尤其是有些扩增片段共用一个引物的时候。这种情况可以通过长扩增片段引物启动 PCR 几个循 环后再加入扩增短片段的引物的方法避免，也可以通过降低扩增短片段的引物来解决。理论上 讲，引物和基因靶序列的摩尔比至少为 108：1 如此过量的引物才能确保模板 DNA 一旦变性就 与引物退火，而不是与其自身退火。一般引物量至少要 10 倍于模板量。

(2) 模板及模板浓度： 从血和新鲜组织中提取的 DNA, 浓度和质量均能满足多重 PCR 的要 求。对于从菌体提取的 DNA, 为了减少样品对扩增结果的影响，裂解液中加入的菌量不能太多， 否则会因裂解不完全，菌体蛋白抑制 DNA 聚合酶的活性，造成假阴性结果。

要达到稳定的结果，每个样品都应该测定浓度，实际工作中往往是抽样检测。所以，样本模 板浓度往往参差不齐，导致每个样本扩增效率不完全均等，有时还会出现扩增失败的现象。此时 要考虑模板的有效浓度，适当加以调整。几种不同来源的模板 DNA 的浓度为： 哺乳动物基因组 DNA 100 μg/mL；酵母基因组 DNA 1 μg/mL；细菌基因组 DNA 0. 1 μg/mL；质粒 DNA l-5ng/mL。

(3)dNTP 和 MgCl2 的浓度：dNTP 和 MgCl2 是 PCR 反应体系中的重要成分，因此对 dNTP 和 MgCl2 的浓度进行优化也是很必要的。
PCR 反应中一般用的 dNTP 和 MgCl2 的浓度分别为 200μmol/L 和 1. 5 mmoI/L。Mg2+浓度在很大程度上影响扩增的特异性，Mg2+一般正比于 dNTP 的浓度，这个比值确定好后可以在调整 其它反应条件时保持恒定。当保持 dNTP 的浓度不变，随着 MgCl2 浓度的升高，反应的特异性 逐渐增强，但当增加到一定程度后，反应产物几乎为零。PCR 反应中，dNTP 和 MgCl2 的浓度应该平衡，这可能是因为 dNTP 能够结合镁离子，而 TaqDNA 聚合酶发挥活性需要游离的镁离 子可另外，dNTP 母液对于反复冻融十分敏感，反复冻融 3〜5 次后，多重 PCR 反应常常不能很 好进行，扩增产物几乎完全不可见，但 dNTP 的这种低稳定性在单一基因扩增中并不明显。

(4)PCR 缓冲液 (KC1) 的浓度： 如果多重 PCR 系统性地对扩增长的 PCR 产物有倾向性， 最佳的选择是设计一系列多重 PCR 实验，固定 Mg2+浓度 (1.5 mmol/L), 依次递增 KCI 的浓度 (1.0〜2. 0 倍)，对每对引物进行再优化。相反，如果倾向于优先扩增较短的产物，则应在保持 KC1 浓度不变的情况下逐步提高 Mg2+浓度 (直至 4. 5mol/L)。如果所有产物的扩增效率都很低， 试着提高模板和热稳定 DNA 聚合酶的浓度。如果没有改善，则成倍增加所有引物的浓度并釆用 复性和延伸温度依次降低 2°C 的降落 PCR。

PCR 缓冲液的浓度从 IX 提高到 2X 可以明显提高多重 PCR 的效率，这种调节作用比调节 DMSO、甘油或 BSA 更重要。通常产生长片段扩增产物的引物在低盐浓度下扩增结果更好，而 产生短片段扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好，高盐浓度会使长片段扩增产物难于变性解链。

(5)Taq DNA 聚合酶： 随着多重 PCR 体系中引物对数目的增多，dNTP 和聚合酶的量也要 相应增加。不同厂家的酶质量也有差异，需要做浓度梯度实验，寻找最佳的用酶量。使用过多的 Taq DNA 聚合酶会导致不同基因扩增不平衡及背景的轻微增高，反应的特异性降低。可以在 25μl 反应体积中加入 2U，然后根据扩增结果进行轻微的调整。

（6）辅助剂 (如 DMSO、甘油、BSA) 的应用： 在多重 PCR 反应体系中加入 50〜100 mL/L 的 DMSO 或甘油能够提高多重扩增效率和敏感性，得到更多的扩增产物和减少非特异扩增。但: 是这些辅助剂可能会在另一方面干扰实验效果，因为它对各基因位点扩增效率的影响不同。 50 mL/L 的 DMSO 可能会提高某一位点的扩增效率，降低另一位点扩增产物的数量，而对某些位点则根本不产生影响；同理，DMSO 可能抑制也可能是促进非特异性扩增。因而使用这些辅助 剂的效果需要在每个具体的反应体系中加以验证。加入适量的 BSA（如 1. 0 g/L）能显著提高多 重 PCR 扩增效率。有时候 BSA 效果要比 DMSO 和甘油好，但它的作用同样也需要实验的验证。
有些研究人员建议使用浓度范围为 5%~10% 体积分数的 DMSO 和甘油来改善扩增的效率和 特异性，但在多重反应中，DMSO 的使用会出现矛盾的结果。因此，DMSO 和甘油的调节对实 验结果的影响要根据具体的实验来摸索。

2. 反应条件的优化

由于在一个多重 PCR 反应体系中有多对引物，而且扩增的模板片段长度也不尽相同，所以 各对引物的扩增效率和扩增速度也不相同。由于多重 PCR 反应总是遵循较小片段优先扩增的原 则，各对引物所要求最佳 PCR 条件也不尽相同（设计多对引物进行多重 PCR 时，应使各引物所 需 PCR 扩增条件尽可能一致），因此在选择多重 PCR 扩增条件（尤其是退火温度和时间）时应 尽量选择有利于较大片段扩增的条件。

（1）退火时间和温度： 在循环参数中，影响多重 PCR 扩增效率的主要因素是复性温度和延 伸时间。复性温度的设置策略与单个 PCR 相似。先计算引物的熔解温度（Tm）, 在此基础上推 算复性温度 Ta（Ta=Tm-5）。然后用「逐步引入法」确定多重 PCR 的最佳 Ta，即每增加一对 引物，就根据扩增的结果调整复性温度，直至每一种被扩增的基因片段都获得满意的效果。延伸 时间是影响扩增产量的重要因素。随着扩增的基因座数目的增加，延伸时间也应延长。在最佳的 Mg2+和 dNTP 浓度范围内通过延长延伸时间来提高扩增产量，比单纯增加 Mg2+和 dNTP 浓度更 为有效。

退火时间对扩增效率的影响远远小于退火温度的影响，将退火温度降低 4〜6°C 对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。多重反应中并发的其它基因的特异扩增会消除非特异扩增 的影响，同样，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。

（2）延伸温度：高的延伸温度会减少某些基因的扩增，即使用长的退火时间和延伸时间也可 能无法消除这种影响。

（3）延伸时间： 在多重 PCR 中，由于同时扩增多个基因，酶和 dNTP 的缺乏就成为限制因 素，就需要更多的时间来完成所有产物的合成。多重 PCR 中增加延伸时间，可以增加较长 PCR 产物的量。也有实验表明，当延伸时间延长时，所有基因的 PCR 产物量都增加了。

（4）PCR 循环数：PCR 产物量增加最明显的是在 25 个循环附近。通常对于一个反应，28〜 30 个循环就足够了，增加至 60 个循环对产物量无明显影响。
总之，多重 PCR 反应条件的设置是一个棘手的问题，也是多重 PCR 成功的保证。一般策略 是首先进行单个 PCR 反应，分别设定各引物对应的条件；然后，依次增加引物对，不断调整反 应条件直至最后保证所有的引物对都能在同一条件下扩增出目的条带。

针对多重 PCR 中的常见问题，可以通过改变影响 PCR 扩增效果的因素来解决。

1. 若所有产物条带都很弱

①增加延伸时间；

②降低延伸温度至 62〜68 笆；

③逐步降低退火温度；

④调整 Tag DNA 聚合酶的浓度；

⑤同时应用以上 4 种策略。

2. 若短片段产物条带较弱

①缓冲液浓度从 IX 增加至 1- 5X 或 2X ;

②降低退火或延伸温度；

③增加弱条带相对应的引物量；

④同时应用以上 3 种策略。

3. 若长片段产物条带较弱

①增加延伸时间；

②增加退火和/或延伸温度；

③增加弱条带相对应的引物浓度；

④降低缓冲液浓度至 0.7X〜0.8X, 同时保持 MgCl2 浓度 1. 5-2 mmol/L 不变；

⑤同时应用以上 4 种策略。

4. 若出现非特异产物

①若非特异产物是长片段，增加缓冲液浓度至 1. 4X〜2. 0X ；

②若是短片段，降低缓冲液浓度至 0.7X-0.9X;

③逐渐增加退火温度；

④减少模板和聚合酶的用量；

⑤增加 Mg2+至 3 mmol/L, 6 mmcd/L、9 mmol/L, 12 mmol/L, 同时保持 dNTP 浓度恒定在 200ptmol/L；

⑥同时应用以上 5 种策略。

5. 若以上方法都未见效，可以进行以下尝试

①加入辅助剂 BSA（0.1-0. 叩 g/以）;

②加入辅助剂 DMSO 或甘油（5%, 体积分数）；

③重新比对引物，确保引物之间不存在相互作用；

④更换所有溶液，用新的 dNTP。