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PCR技术

巢式 PCR-限制性片段长度多态性

2024-05-14 PCR技术 加入收藏
简介巢式 PCR-RFLP(nested PCR-RFLP)是将限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorp

简介

巢式 PCR-RFLP(nested PCR-RFLP)是将限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphism,RFLP) 与巢式 PCR 技术相结合,通过设计高度 保守序列的引物对待检物种 DNA 进行 PCR 扩增,对 PCR 产物进行 RFLP 分析。

原理

巢式 PCR-限制性片段长度多态性的基本原理是:根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位 点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失,导致酶切片段大小发生了变化,这 种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种(个体) 的 DNA 水平的差异(即 多态性),多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种 基因组 DNA 的克隆,位于染色体的不同位点,从而可以作为一种分子标记(mark)构建分子图谱。当某个性状(基因)与某个(些)分子标记协同分离时,表明这个性状(基因)与分子标记 连锁。分子标记与性状之间交换值的大小,即表示目标基因与分子标记之间的距离,从而可将基 因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上,可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组 DNA 后,所切的片段类型不一样,因此,限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。

用途

巢式 PCR-限制性片段长度多态性的常用应用领域如下:流行病学调查和临床常规检测。

材料与仪器

器材:PCR 扩增仪、电泳仪

试剂:

① 模板: 基因组 DNA 或 cDNA

② 2.5 mmol/L dNTP 混合液

③ 10 umol/L 四条特异引物: 两条外引物,两条内引物

④ TaqDNA 聚合酶

⑤ 高压灭菌去离子水

⑥ 限制性内切酶及其 10× 缓冲液

步骤

巢式 PCR-限制性片段长度多态性的基本过程可分为如下几步:

(一)引物设计

巢式 PCR 的引物设计原则与常规 PCR 相同。通常内引物与外引物的间隔距离也没有统一的 要求,具体情况根据每个实验而定。

(二)巢式 PCR 反应

A. PCR 反应体系:

设立 50 pl 的 PCR 反应体系,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

10× PCR 缓冲液 5 μl

DNA 或 cDNA 模板 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 (5U/μl) 0.5 μl

10 μmol/L 的外引物 (P1、P2) 各 1 μl

H2O 至 50 μl

如果 PCR 仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油 (约 50 μl)。将 PCR 试管放入到 PCR 仪上。

B. 设置 PCR 反应条件:

预变性 94 ℃,3 min

变性 94 ℃,30 s

退火 55 ℃,30 s 30 个循环

延伸 72 ℃,60 s

延伸 72 ℃,7 min

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

C. 进行第二轮 PCR 反应,在 0.25 ml 的 PCR 管中,分别加入:

10× PCR 缓冲液 5 μl

第一轮 PCR 产物 5 μl

2.5 mmol/L 的 dNTP 混合液 1 μl

Taq DNA 聚合酶 (5U/μl) 0.5 μl

10 μmol/L 的内引物 (P3 ,P4) 各 1 μl

H2O 至 50 μl

PCR 反应条件同第一轮。

D. PCR 产物的检测

反应结束后,用 10 μl 第二轮 PCR 反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。

(三)PCR 产物酶切

当获得第二轮的 PCR 产物后,选用适当的限制性内切酶,酶切位点的选择要根据已有序列的分析,酶切的反应体系为 20 μl。

10× 内切酶缓冲液 2 μl

第二轮 PCR 反应的产物 10 μl

限制性内切酶 10 U

H2O 至 20 μl

37 °C 水浴 5 h。

(四)酶切产物的检测

获得酶切产物后,要根据目的片段的大小选择不同的琼脂糖浓度。因酶切产生的片段能小于 100 bp,所以用琼脂糖浓度应当比平时高一些,例如 2%~5%,如果酶切产生的片段大部分小于 500 bp,可用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。如果酶切产物的浓度较低,可用杂交的方式来增加灵敏度。

注意事项

扩增的基因要选择适合进行 RFLP 分析的区域,尽量选择常用的限制性内切酶,分型位点不能过于接近。有时出现一些稀有酶的酶切位点,会导致酶切效率下降或费用昂贵。未酶切的 DNA 要防止发生降解,酶切反应一定要彻底。


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