巢式 PCR
原理
使用扩增片段的内外两对引物进行两轮 PCR 扩增来提高引物与目的基因片段的特异性和灵敏性，以防止非特异性结合和非特异性产物的生成。
用途
常规使用的一对引物的 PCR 可能会发生引物与模板的非特异性结合，为了提高特异性，选用目的基因内外两层引物进行两轮扩增，在前一轮的产物中进行二次筛选，双重保险以获得特异性的目的片段。
常用于高遗传变异性的病毒检测以提高检测率，也可用于常规 PCR 扩增产物时，核酸胶检测产物弥散高亮，但未出现明显条带时；也适用于模板质粒质量差或丰度较低时。
材料与仪器
试剂：
① 灭菌水
② Fast Pfu DNA 聚合酶及 PCR 缓冲液
③ 模板质粒以及内外两对引物
④ dNTP mix DNA 纯化回收试剂盒
仪器：PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、枪头和移液器
步骤
一、第一轮 PCR 扩增
目的 DNA 模板与第一对外侧的引物结合后进行 PCR 扩增。由于只有一对引物可能发生特异性结合，产物中会有目的基因片段和非特异性片段。
条件设置：
2. 变性：94 ℃，45 秒；
3. 退火：58 ℃，45 秒；
4. 延申：72 ℃，45秒；
5. PCR 循环：36个
二、第二轮 PCR 扩增
使用目的基因内侧的第二对引物，即巢式引物，对第一轮的 PCR 产物进行扩增，双重筛选以调取目的基因片段。PCR 反应条件同第一轮。
三、PCR 产物的检测
将两轮 PCR 产物进行凝胶电泳分析，以检验产物片段大小是否正确，进行胶回收 DNA 纯化，转化后挑克隆送测序。
注意事项
1、注意检测模板质粒质量以及各引物浓度；
2、外侧引物比内测引物的 Tm 值高 4 ℃ 以上；
3、外侧引物距离内侧引物要多于 6 bp；
4、第一轮 PCR 扩增时，应尽量摸索最低的外侧引物加入量，并增加扩增循环数，以消耗尽外侧引物，避免第二轮时继续扩增造成非特异性污染。
常见问题
1、一轮用外侧引物 PCR 产物中出现非特异性条带
原因常见：
引物与靶序列不完全互补，非特异性结合用巢式 PCR 解决。但也可能是由于引物浓度过高、聚合形成二聚体/酶的质和量不佳/退火温度过低/ PCR 循环数过多所致，
对策：
必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93 ℃ 变性，65 ℃ 左右退火与延伸）等
2、PCR 扩增产物出现片状拖带/涂抹带
往往是由于模板质粒质量不好、酶量过多、dNTP 浓度过高、循环次数过多时引起，常规 PCR 出现非特异性结合的情况极少，建议先排查掉这些原因再进一步使用巢式 PCR。
相关文章
