单细胞 PCR

单细胞 PCR 技术是从生命的基本单位--细胞水平上进行 DNA 或 RNA 分析的 PCR 方法。

单细胞 PCR 的基本原理是分离出单个细胞后，将细胞裂解，释放出目的 DNA 或 RNA。若分析 DNA，以裂解细胞而不破坏细胞核为宜，然后以裂解产物为模板进行 PCR 反应。若分析 RNA，要先将 RNA 反转录成 cDNA，然后进行 PCR 反应。

器材：流式细胞仪、PCR 仪、离心机、电泳仪

试剂：

1、单细胞分离的试剂：

台盼蓝、PBS、单克隆抗体、胶体金、10% 二甲基亚砜（DMSO）、0.9% 的 NaCl 溶液、0.5% 胰酶、0.04 mg/ml DNA 酶、0.16% 羟丙基甲基纤维素（HPMC）、碱性磷酸酶-快红、苏木精

2、单细胞PCR试剂：

A. 1 × PCR反应缓冲液（50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl pH8.3，2.5

mmol/L MgCl2，0.1 mg/ml 明胶）

B. 0.05 mg/ml 蛋白酶 K

C. 20 mmol/L DTT

D. 1.7 μmol/L SDS

E. PCR 引物

F. dNTP

G. Taq DNA 聚合酶

3、单细胞 PCR 产物分析试剂：

A. SSC 缓冲液

B. 50% 去离子甲酰胺

C. 5 × Denhardt 液

D. 鲑鱼精 DNA

E. SDS

F. 0.1% Na2H2P2O7

G. SET 缓冲液

单细胞 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）单细胞的分离

1、单个淋巴细胞的分离用相同体积的 RPMI1640 培养基在 50 ml 离心管中稀释 10 ml 血液，再在上层覆盖 20 ml 已放置到室温的 Ficoll-Paque Plus，室温 500 g 离心 20 min，小心吸出中间暗黄色的液层，放于 50 ml 的离心管中。用 40 ml PBS 重悬细胞，500 g 离心 15 min，弃上清，用 10 ml PBS 重悬细胞。 取 10 μl 细胞悬液，加入 15 μl PBS 和 25 μl 台盼蓝，进行细胞计数。将细胞悬液 300 g 离心 5 min 后，重悬于 PBS 中至细胞浓度为 2 × 107 个/ml。 取 50 μl 细胞悬液于 5 ml 的离心管中，加入 20 μl 未稀释的单克隆抗体（如抗 CD19 的单克隆抗体），4 ℃ 避光放置 30 min。用 4 ml PBS 洗细胞两次，每次 120 g 离心 5 min。用 0.5 ml PBS 重悬细胞，用流式细胞仪分选细胞。 -80 ℃ 保存。

2、从新鲜组织中分离单个细胞以大鼠视网膜神经节细胞为例进行说明：

（1）视网膜神经节细胞的逆行标记：试验用的动物在进行手术解剖前，首先腹腔注射 Rompun 和 Ketalar 的混合剂，注射的剂量分别为：10~15 mg/kg 及 30~100 mg/kg 体重。视网膜神经节细胞从上丘用荧光示踪物——胶体金进行逆行标记。当暴露后，将一块吸收了 3% 的胶体金和 10% 二甲基亚砜（DMSO）的 0.9% 的 NaCl 溶液的明胶海绵覆盖上丘表面。这样细胞末端将暴露于胶体金，并逆行转移至视网膜中的神经细胞体。最优化的标记效果是加人胶体金后作用 7 d。动物腹腔注射 3~4 ml 苯巴比妥处死。眼周的颞-鼻边缘用缝线标记，摘下眼球迅速置于冰上准备解剖。

（2）机械分层法分离视网膜神经节细胞：在无菌的 PBS 缓冲液中分离出眼球，小心地将视网膜从巩膜上分离并分成四份。用镊子将一片视网膜放置在硝酸纤维素膜（5 mm × 5 mm）上，将感光器朝向硝酸纤维素膜。去除玻璃体，将硝酸纤维素膜和视网膜放在含有 0.5% 胰酶和 0.04 mg/ml DNA 酶的 PBS 中于 37 ℃ 作用 15 min。将硝酸纤维素膜放在 Millipore 的滤纸上 5 s，吸去多余的液体，然后内层视网膜朝下放在未经包被的盖玻片（24 mm × 60 mm）上。将一片稍小的盖玻片（24 mm×32 mm）放在 Millipore 的滤纸上以促进黏附在玻璃表面，构成「三明治」样的结构，置于 37 ℃ 放置 5 min。将小盖玻片去掉，用镊子小心地掀起滤纸和视网膜即可得到分离的薄层。分离到的细胞立即放入含有 0.16% 羟丙基甲基纤维素（HPMC）的 PBS 中以增大黏度稳定细胞。

（3）单个视网膜神经节细胞的收集：细胞保存在最初的盖玻片上，在倒置荧光显微镜下挑取细胞。单个的视网膜神经节细胞可以由胶体金发出的光分辨出来，用手控的微量加样器吸取置于 PCR 管中。

3、从组织切片上分离单个细胞冷冻切片 5~10 μm 厚，干燥过夜，次日于丙酮中固定 10 min，干燥 20 min。滴加适当的单克隆抗体，按 ABC 法进行免疫组织化学染色，采用碱性磷酸酶-快红显色，苏木精复染。在已进行染色的切片，上滴加 0.01 mol/L TBS（pH7.4）缓冲液。 光镜下先用 20 倍物镜×10 倍目镜找到所需细胞，然后在 60 倍物镜×10 倍目镜下，用硬质玻璃微电极毛坯（Narishige，日本）拉制而成的直径为 1~2 μm 的分离微吸管仔细分离所需细胞，使其与周围的细胞分离。并将其送入用硬质玻璃微电极毛坯拉制而成的直径为 10~20 μm 的吸取微吸管内，通过液压传动装置将细胞吸入 PCR 管中。-20 ℃ 保存。

（二）单细胞 PCR

① 将单个细胞移人预先加入 20 μl 裂解液的 PCR 管中。其中包含有 1 × PCR 反应缓冲液（50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl pH8.3，2.5 mmol/L MgCl2， 0.1 mg/ml 明胶）和 0.05 mg/ml 蛋白酶 K，20 mmol/L DTT，1.7 μmol/L SDS。

② 37 ℃ 温浴 1 h 后，将样品加热至 85 ℃。

③ 将样品加至 100 μl PCR 反应体系，包括: 1 × PCR 反应缓冲液，1 μmol/L 的 PCR 引物（每种 1 μmol/L），187.5 μmol/L 的 dNTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP， 每种 187.5 μmol/L），100 ng 的模板 DNA 和 2 U 的 Taq DNA 聚合酶。

④ 根据引物的退火温度和预期扩增的片段大小设计 PCR 反应的条件，标准的反应条件为：95 ℃，变性 5 min；95 ℃，30 s，55 ℃（视 PCR 引物的退火温度而定），30 s， 72 ℃，40 s（视 PCR 预期扩增的片段大小而定），循环反应 30~50 次；72 ℃ 反应 10 min。

（三）单细胞 PCR 产物的分析

将 PCR 产物直接进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，进行 EB 染色，在紫外照射条件下，分析扩增产物。大多数条件下一轮 PCR 反应得到的产物不足以用 EB 染色显示出来，需进行点杂交或 Southern blot 做进一步分析。

1、点杂交

（1）样膜的制备

① DNA 样品的预变性样品：DNA 溶于水或 TE 中，煮沸 5~10 min，冰浴中迅速冷却，使其变性。

② 尼龙膜的预处理戴上干净的手套，将尼龙膜按需要剪成合适大小，并剪掉一角作为点样顺序标记。如采用手工点样，用铅笔在尼龙膜上按 0.8~1.0 cm2 的面积上标上小格。用蒸馏水浸湿，再浸入 6×SSC 至少 30 min，将膜取出风于待用。

③ 点样可根据情况手工直接点样或用真空抽滤加样器（斑点或狭缝）点样。手工直接点样：用微量移液器将经变性处理的核酸样品依次点到尼龙膜的标记点上。斑点直径不要过大，应控制在 0.5 cm2 以内。单个样品分少量多次点样，边点样边风干。

斑点真空抽滤加样器点样：

a. 常规方法清洗加样器后，用 0.1 mol/L 的 NaOH 清洗点样器，无菌三蒸水充分冲洗；

b. 将尼龙膜湿润后覆盖在加样器支持垫上（或为预先湿润的滤纸），小心排除气泡，尼龙膜覆盖不到的部位需用 Parafilm 膜封闭，重新安装好加样器，接通真空泵；

c. 在加样孔加满 10×SSC，抽滤至所有液体被抽干，关闭真空泵，重复一次；

d. 将上述经预变性处理的样品加入 2 倍体积 20×SSC 后加至各孔，真空抽滤，待全部液体抽干后，再加 10×SSC 抽滤两次；

e. 等 10×SSC 抽滤完后，继续维持真空 5 min，使尼龙膜干燥。

④固定：点样后的样膜置滤纸上，室温自然风干，然后真空 80 ℃ 烘烤 2 h 固定核酸样品。固定后的样膜，封存于塑料袋内待用（-20 ℃ 可保存若干月）。

（2）预杂交将样膜用 2×SSC 浸湿后，放人杂交管中，加入 10~20 ml 预杂交液，在杂交炉中，42 ℃ 温育 2~4 h。

预杂交液各组分的终浓度为：6×SSC， 50% 去离子甲酰胺，5×Denhardt 液，0.5 mg/ml 鲑鱼精 DNA， 0.5% SDS。

（3）杂交

①配制杂交液（终浓度）：6×SSC；5×Denhardt 液；50% 去离子甲酰胶；0.1 mg/ml 鮭鱼精 DNA；0.5% SDS。

②探针变性：采用放射性标记的双链 DNA 探针，需变性处理。一般将 DNA 探针在沸水浴中煮沸 5 min，然后迅速置冰浴中。

③杂交：从杂交炉中取出杂交管，弃预杂交液，加入 5~10 ml 杂交液。加入放射性标记的探针，小心排除气泡，置 42 ℃ 温育，一般为 16~20 h。

（4）洗膜杂交结束后， 将杂交液倒入放射性废物容器中，取出样膜，放进装有 2×SSC/0.1% SDS 的盘中，室温摇晃漂洗 5 min。2×SSC/0.1% SDS 室温洗两次，每次 15 min；0.1×SSC/0.1% SDS 室温洗两次，每次 15 min；0.1×SSC /0.1% SDS 55 ℃ 洗两次，每次 15 min。

（5）放射自显影样膜经漂洗后，置干净滤纸上，吸去膜上多余的水分，外面裹一层保鲜膜。置于暗盒中，在样膜的上面压一张 X 光片，-80 ℃ 放射自显影 24~48 h 后，按常规冲洗 X 光片：显影 1~5 min；定影 5 min；流水冲洗 10 min，自然干燥。

（6）结果观察根据曝光点的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及量的多少。利用「自动灰度扫描仪」扫描曝光点，计算积分光密度值，可以进行半定量分析。

2、Southern blot

① 将 PCR 产物在琼脂糖凝胶（0.65%~0.8%）上缓慢电泳（1V/cm）， 24~48 h。

② 电泳完毕后在紫外光下照相，沿凝胶边缘放置一透明荧光直尺，以便能从照片中读出 DNA 标准参照物的迁移距离。

③ 将凝胶置于数倍体积的 0.25 mol/L HCI 中浸泡 20 min，并且温和地不断振摇。

④ 将凝胶浸泡于数倍体积的变性缓冲液中（1.5 mol/L NaCl，0.5 N NaOH），浸泡 30 min，温和振摇。

⑤ 弃去变性缓冲液，加入数倍体积的中和缓冲液（1 mol/L Tris HCI pH7.4，1.5 mol/L NaCI），于室温不断振摇 30 min。

⑥ 将凝胶置于 20×SSPE 中，室温 30 min。

⑦ 用毛细管转移法或电转移法将 DNA 从琼脂糖凝胶中电转移到硝酸纤维素滤膜上。

⑧ 转移结束后，用铅笔标记凝胶加样孔的位置。

⑨ UV 照射交联（120 mJ/cm2）。

⑩ 2×SSPE 室温漂洗。

⑪ 将滤膜置于两组 3 MM 滤纸中间，用真空炉于 80 ℃ 干烤 1 h。

⑫ 将滤膜置于预杂交液中（10×Denhard's，4X SET，0.1% SDS，0.1% Na2H2P2O7，100 pg/ml 变性的鲑精 DNA），杂交瓶中 65 ℃ 温育 1 h。

⑬ 将 DNA 探针和鲑精 DNA 于 100 ℃ 加热 5 min 使其变性，迅速置于冰上 5 min。

⑮ 取 200 μl DNA 探针和 100 μl（10 mg/ml）鲑精 DNA 加入 10 ml 新的预杂交液中。将杂交瓶中的预杂交液弃去，加入含有变性探针的杂交液。65 ℃ 杂交过夜。

⑯ 将滤膜转移至盛有数百毫升的漂洗缓冲液（0.4×SET，0.1% SDS，0.1% Na2H2P2O7）中，于 65 ℃ 水浴摇床中温和摇动漂洗两次，每次 10 min。

⑰ 将滤膜置于两张 3 MM 纸中稍事干燥，用 Saran 保鲜膜包好滤膜，贴上数张荧光标签，以便以后校准放射自显影与滤膜的位置。

⑱ 将滤膜置于 X 光片夹中于 -70 ℃ 加增感屏曝光 12~48 h。

⑲ 按常规冲洗 X 光片: 显影 1~5 min；定影 5 min；流水冲洗 10 min，自然干燥。

⑳ 根据曝光点的有无、强弱，可以判定目的基因的有无及量的多少。利用「自动灰度扫描仪」扫描曝光点，计算积分光密度值，可以进行半定量分析。附：20 X SET 缓冲液：3 mol/L，NaCl 0.4 mol/L，Tris-HCl， pH7.5，20 mmol/L EDTA

3. 单细胞 RT-PCR

① 融化含有单个细胞的 PCR 管，在冰上加入 3 μl 5% NP-40 和 1 μl 15 mmol/L 待分析基因的反转录引物或 oligodT 引物。然后将 PCR 管加热至 65 ℃，放置 3 min 后，于 25 ℃ 冷却 3 min 后，置冰上冷却。

② 向 PCR 管中加入 2 μl 10× 反转录缓冲液、2 μl DTT、1 μl 10 mol/L dNTP 和 0.5 μl 反转录酶（如 Superscript II RT），加入无 RNase 的水至终体积 19.5 μl。

③ 将 PCR 管置于 37 ℃，反应 1 h，合成第一条 cDNA 链后，加热至 70 ℃，保持 10 min，灭活反转录酶。

④ 用第 3 步得到的 cDNA 混合物作为模板进行 PCR 反应。在 PCR 管中，混合下列溶液:

cDNA 混合物                       8 μl

20 μmol/L 上游引物            0.5 μl

20 μmol/L 下游引物            0.5 μl

10×Pfu PCR 反应缓冲液      6 μl

5 U/μl Pfu 聚合酶                1 μl

10 mmol/L dNTP                1.6 μl

加水至终体积 60 μl。

⑤ 按标准的 PCR 反应程序进行 PCR 反应。通常的单细胞 RT-PCR 反应要进行两轮 PCR 反应，进行第二轮 PCR 反应时，以第一轮 PCR 反应的产物作为 PCR 反应的模板，设计第一轮 PCR 反应引物的内侧引物进行巢式 PCR 反应。

⑥ 单细胞 RT-PCR 产物的分析。第一轮 PCR 反应或第二轮 PCR 反应的产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳后，用 QIAquick 凝胶回收试剂盒纯化回收后，进行测序。并与数据库中的序列进行比较分析。若要进行半定量分析，可在第一轮 PCR 反应结束后，对 PCR 产物进行点杂交或 Southern Blot 分析。

① 尽管单细胞 PCR 有许多优越性，但在操作上有较大难度，对实验室的要求颇高，工作量非常大，因此目前只有少数单位能够开展。首先由于研究对象是单个细胞，因而要严格防止污染。因此除实验器具要严格消毒，以及设置各种对照排除干扰外，操作者自身也应注意不能携带能造成污染的物品进入单细胞操作室。

一般对单细胞 PCR 应采取重复实验以及双盲法。应采取以下具体措施：

a. 在进入单细胞操作室前必须沐浴，然后在准备室内换上专用制服和工作鞋，并戴上手套，尤其要注意的是其它实验室的物品一律不得带入单细胞室；

b. 枪头、移液器、试剂等所有实验物品必须为单细胞室专用；

c. 单细胞提取时所需要的微吸管必须经髙温消毒，每挑选一个细胞更换一次微吸管；

d. 免疫组化也必须在专用实验室内进行，要求与进入单细胞室相同；

e. PCR 反应前各种试剂的配制、加模板、PCR 反应、电泳检测 PCR 产物要分别在不同房间进行；

f. 经常更换手套（尤其是在接触 DNA 模板和 PCR 产物后），采用防止气溶胶的一次性吸管头等；

g. 设立缓冲液对照，即只吸取覆盖在切片上的缓冲液，而不吸取细胞成分，在这种情况下，PCR 扩增也应该全为阴性，若出现阳性条带，证明覆盖在切片上的缓冲液内有细胞污染。

②单细胞提取的难度还在于其需要非常高的准确性，这取决于仪器设备的精度和操作者的水平。操作时应最大限度地避免邻近细胞的污染，单细胞提取后，往往还需进行 PCR 反应和 DNA 测序。这就对模板的量和纯度提出了较高的要求。与常规利用全组织提取 DNA 相比，单细胞 DNA 的纯度明显增高，但量相应减少，导致单细胞 PCR 的扩增效率低于全组织 PCR，增大了工作量。

③ 单细胞 PCR 的扩增效率较全组织 PCR 低，其原因有如下几点：

a. 从组织切片分离单个细胞时，5~10 μm 的冷冻切片使单个细胞的细胞核发生部分丢失，细胞越大丢失成分越多，其弥补措施为增加冷冻切片的厚度，尽可能保证细胞核的完整性。

b. 单细胞操作不允许用苯酚、氯仿进行抽提，因为这会使本来已很微量的 DNA 丢失，采用蛋白酶 K 消化，尔后再灭活蛋白酶 K 的方法，但是这种纯化方法不能保证每个细胞的 DNA 都达到 PCR 扩增的要求

c. 在吸取细胞时微吸管管尖因毛细吸附作用会引起缓冲液内流，若控制不好，内流增多，导致整个体系中缓冲液浓度改变，同样会得不到阳性结果

d. 切片、免疫组织化学、单细胞提取的过程需要较长的时间且步骤复杂，可能会使细胞 DNA 受到损伤。上述诸点造成单细胞扩增的效率一般最高仅为全组织的 50% 左右。