双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是A. Lermo等人提出的一种新的可以替代传统的食品检测的方法，实现了快速、实时、多元的对食品污染的检测。

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是先将待检病原菌相关的单克隆抗体标记在胶体金颗粒上制成免疫胶体金试剂，通过特异性抗体的免疫反应将待检病原菌吸附在胶体金颗粒上，然后提取病原菌的DNA,通过PCR反应来实现遗传物质的进一步放大。

PCR 的基本原理和操作方法与常规PCR类似，不同之处仅在于用生物素和地高辛分别标记PCR的上下游引物，因此扩增产物也带有双标记，可进行免疫学检测，从而可以快速、灵敏和准确地检测食品中污染的病原菌。

双标记PCR可用于对污染了食物的各种病原菌进行检测，与用敏感电极m-GEC进行电化学检测结合，提供了一-种快速、经济、灵敏的对致病菌定性分析的方法。

试剂：

①从病原菌中提取的模板DNA,生物素；
②地高辛；
③Taq DNA聚合酶；
④10X×Taq酶反应缓冲液(0.1 mol/L Tris-Cl pH 8.8，15 mmol/L MgCl，0.5 mol/L KCl，1% TritonX 100)；

⑤250 μmol/L dNTP；
⑥用生物素和地高辛标记的上下游引物，浓度均为10 pmol；
⑦含0. 5 μg/ml EB的1% 琼脂糖凝胶。

双标记PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步：

A.配制100 μl的PCR体系。
10X×Taq酶反应缓冲液：10 μl；
下游地高辛标记引物(10 pmol)：1 μl；
DNA模版(2 μg/l)：1 μl；
Taq DNA聚合酶(1.0 U/μl) ：0.5 μl；
dNTP (250 μmol/L)：1 μl；
上游生物素标记引物(10 pmol)：1 μl；
加ddH2O至100 μl。

B.设置PCR反应程序。
95C：5 min；
95C：30 s；
60°C：30 s；
72°C：30 s；
72C：7 min。
PCR分别在循环次数为5、10、15、20、25、30 循环时停止。

注意事项：

在相同的100 μl 的反应混合体系和条件中变化模版DNA的量(7种各相差10倍的稀释度，从4.5 ng/μl到4. 5 fg/μl)，DNA扩增反应分别在第5、10、15、 20、25、30 循环停止。

所有的扩增反应包括-一个空白对照(不加病原菌DNA模版)。扩增产物通过电泳分析。由于引物是由生物素和地高辛标记的，扩增产物的末端也应该分别带有双标记，因此可以进行免疫学检测。

1.引物要设计在致病菌基因序列的共有区，此外要保证双标记PCR扩增产物的特异性。
2.用电化学方法检测双标记产物的方法十分灵敏，在PCR反应10个循环后，4.5 ng/μl和0.45 ng/μl的病原菌基因组DNA可以分别用Av-GEB和m-GEC方法检测到。