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PCR技术

建立一个实时 PCR 定量分析实验

PCR
2024-05-16 PCR技术 加入收藏
材料与仪器MgCl2 探针 HotStmMix 正向和反向扩增引物 模板 DNAPCR 仪 反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板步骤一、材料1. 缓冲液和溶液

材料与仪器

MgCl2 探针 HotStmMix 正向和反向扩增引物 模板 DNA
PCR 仪 反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

MgCl2(25 mmol/L)

探针(例如分子信号)或 SYBRGreen(MolecularProbes)

2. 酶和酶缓冲液

HotStmMix,2X(含有 TaqDNA 聚合酶、PCR 缓冲液和 dNTP)

3. 核酸和寡核苷酸

正向和反向扩增引物

模板 DNA

4. 专用设备

实时 PCR 仪

合适的反应管、毛细管或 96 孔的微量滴定板(按照不同的方法选用)

二、方法 A----ABI7700ORI-CYCLER

1.在 96 孔的微量滴定板上为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen,按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。

2XHotStartMix                                                    25ul
引物 A                                                               0.1~ 0.5umol/L
引物 B                                                               0.1~ 0.5umol/L
探针或 SYBRGreen                                          0.1~ 0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                             3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                    10ul
水                                                                      补满到 50ul

2.使用两步(所有的 ABI7700TaqMan 定量分析)或三步 PCR。对于三步 PCR, 利用如下条件运行 40~50 个循环进行扩增。



对于两步 PCR,省去 72°C 延伸,增加退火温度到 60°C。
~undefined取决于 HotStart 程序。

3.继续进行下文步骤④的优化方案。

三、方法 B—SMARTCYCLER

1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen, 按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。

2XHotStartMix                                              2.5ul
引物 A                                                         0.3~0.8umol/L
引物 B                                                          0.3~0.8umol/L
探针或 SYBRGreen                                     0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                       3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                               5ul
水                                                                 补满到 25ul

Smartcycler 要求使用专用的管子。

2.利用两步或三步 PCR。对于三步 PCR,利用如下条件运行 40 个循环进行扩增。



对于两步 PCR,省去 72°C 延伸,增加退火温度到 60°C。
~undefined取决于 HotStart 程序。

3.继续进行下文步骤4的优化方案。

四、方法 C-----LIGHTCYCLERPCR

1.在适当的管中为每个反应集中如下的 PCR 组分。混合 HotStart 混合物和引物及探针/SYBRGreen,按要求的量加入模板。共有 5 种 10 倍稀释的模板 DNA。

2XFastStartMix                                              10ul
引物 A                                                            0.1~0.5umol/L
引物 B                                                            0.1~0.5umol/L
探针或 SYBRGreeundefined                                      0.1~0.5umol/L
MgCl2(25 mmol/L)                                          3~6 mmol/L
模板 DNA(500ng~50pg)                                 5ul
水                                                                   补满到 20ul

~undefinedLightCycler 要求使用毛细管。

2.利用三步 PCR, 如下条件运行 40(原文为 45—译者改)个循环进行扩增。



3.继续进行下文步骤④的优化方案。
优化定置分析的实用方法(见 InnisandGelfand1990;HarrisandJones1997)

4.为了优化扩增子和引物,利用解链曲线功能分析实时 PCR 产物,此功能在 ABI770上不能直接获得。对单个产物而言,结果应显示其具有一个特异的解链峰,没有表明形成引物二聚体的次级烽。当解链曲线数据以一阶导数表示时将会是一单峰。多个峰表明有其他的扩增产物存在。如果检测到多个峰,说明可能需要进一步优化镁离子的浓度,但通常这表明需要重新设计引物。

5.为了优化探针,可利用靶分子的 1 倍稀释液,选择任意单位作标准曲线。例如假定DNA 的最高浓度值是 107,由此它的 10 倍稀释系列分别定为 107、106、105、104、103。鍵入这些数值作为起始量,在定量分析结束时用软件作标准曲线。利用循环阈(Ct) 值和DNA 的起始浓度将可计算反应效率。

6.与常规 PCR 相似,需用一系列按 10 倍稀释的标准液做进一步反应,以优化 MgCl2的浓度、引物浓度、探针浓度、退火温度,以及调整 PCR 方案。

7.对于本身没有快速循环操作方案的体系,可以尝试进行更短的循环方案,以减少定量分析的时间。


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