降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用是代表了一种完全不同的PCR优化方法，并不去尝试改变缓冲液、循环条件等，优化只集中在一个参数一退 火温度上，并且在一个程序中，可采取一系列不同的退火温度。

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本原理是每一个(或n个)循环降低1 °C (或n °C)退火温度，直至达到一-个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown"退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。

据统计，正确和非正确退火温度之间的1°C差异将造成PCR产物量的4倍差异，如果相差5℃，就会产生45(1024) 倍的优势，因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。

退火温度起始在高于计算的Tm值的15C左右，在接下来的循环中，退火温度以每次1~2 ℃逐渐降低，直到Tm值以下5 ℃,当达到特异的引物模板结合的Tm值时，扩增就会开始。

当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势，在剩余反应中，特异产物优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。

这种方法主要用于避免非特异PCR产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组DNA模板，非特异的退火更容易发生时。

降落PCR中正确的产物得到富集，原理在于温度的升高提高了PCR扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严紧性，待目的基因的丰度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争)。

但是，降落PCR无法改善扩增效率低的问题，-般用于在杂模板中提高扩增特异性。

1.降落PCR有着很广泛的应用，主要用于增加PCR的特异性和敏感性。例如在临床诊断方面，引起间质性浆细胞肺炎( pneumocystis carnii pneumonia)的卡氏肺孢子虫的检测，传统的检测方法是组织的显微镜检测，费时，而且敏感度不够，现在有很多研究者使用PCR的方法进行检测，他们把降落PCR与定量PCR结合起来，检测样品中的病原数量，敏感性好，精确度也高。

2.降落PCR的另一个应用是在确定已知氨基酸序列肽的DNA序列。具体过程如下:使用两条与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，需要知道一段长为13个氨基酸的肽段序列，5'和3'引物各长18个碱基(6 个氨基酸)，两者之间有-一个碱基或更长的间隔，进行“touchdownPCR"。

由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。

如果克隆和测序几个PCR产物，将可以确定肽的正确编码DNA序列，可用于设计进行杂交的寡核苷酸。该技术特别适用于由Ser, Lys和Arg (每个有6个密码子)构成的多肽。

试剂：

①10× PCR缓冲液: 15 mmol/L MgCl2，500 mmol/L KCl, 100 mmol/L Tris-Cl，0. 1% (体积分数) Triton X-100；
②dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为25 mmol/L；
③正、反向特异引物:两者的引物均为10 μmol/L；
④模板:可以是cDNA、基因组DNA或其它DNA；
⑤TaqDNA聚合酶；
⑥高压灭菌去离子水；
⑦用于琼脂糖凝胶电泳的试剂；
⑧PCR扩增仪:具有降落PCR程序，如PE Genamp PCR System 2400。

降落PCR在临床诊断及流行病调查中的应用的基本过程可分为如下几步：

A. 设立50μl的PCR反应体系在0.25 ml的PCR管中，分别加入:
10× PCR缓冲液：5 μl；
DNA模板：5 μl(100 ng)；
2.5 mmol/L的dNTP混合液：1 μl；
Taq DNA聚合酶(5 U/μl)：0.5 μl；
10 μmol/L的外引物(P1、P2)各1 μl；
H2O至50 μl。

注意事项：如果PCR仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油(约50 pul)。将PCR试管放人到PCR仪上。

B. 设置PCR反应条件 常规PCR方法一般是25~35个循环，降落PCR一般要比它多5~10个循环，为35~40个循环，因为降落PCR程序开始的温度高于最适退火温度(未知)，在降落PCR程序中，有效的扩增直到运行几个循环(不确定)后才开始，为了补偿，降落PCR要比常规PCR多运行几个循环。下面给出一个降落PCR的程序:

①94 °C预变性3 min;
②94 °C变性30 s，65 °C退火 30 s，72 °C延伸1 min (目的片段为1 kb) ;
③以后每个循环退火温度降低1 °C，共20个循环一退火温度从65 °C降落到45 °C;
④94 °C变性30 s，45 °C退火30 s，72 °C 延伸1 min, 15~20个循环; .
⑤72 °C延伸10 min;
⑥4 °C保存。

注意事项：

PCR反应中的延伸时间要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成1000 bp左右。

C.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳反应结束后，用10 μl反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析，一般来说琼脂糖浓度为1 %，缓冲液为1XTAE。若试验成功，应出现一条目的带，至少目的带的亮度与其它非特异扩增带相比，差异显著。

1. 引物：根据所需扩增片段，设计两条特异引物，设计引物的原理同常规PCR，引物的贮存浓度通常为10 μmol/L。
2. 模板：可以是cDNA基因组DNA或其它DNA。