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PCR技术

消减杂交实验

2024-05-16 PCR技术 加入收藏
材料与仪器稀释缓冲液 杂交缓冲储存液 基三乙基溴化铵 矿物油 核酸和寡核苷酸热循环仪步骤一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂稀释缓冲液(20 mmol/L HEPE

材料与仪器

稀释缓冲液 杂交缓冲储存液 基三乙基溴化铵 矿物油 核酸和寡核苷酸
热循环仪

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

稀释缓冲液(20 mmol/L HEPES>HCl、pH8.3,50 mmol/LNaCl,0.2 mmol/L EDTA)

4X 杂交缓冲储存液:4mol/L NaCl,200 mmol/L HEPES、pH8.3,4 mmol/L 十六烷

基三乙基溴化铵(CTAB)。最终的 1X 杂交缓冲液,用稀释缓冲液稀释。

矿物油

2. 核酸和寡核苷酸

连接 Ad1 的检测者 1-1(方案 1 第 4 阶段第 8 步)

连接 Ad2R 的检测者 1-2(方案 1 第 4 阶段第 8 步)

驱动 DNA(方案 1 第 3 阶段第 5 步)

Rsa I 消化的驱动 DNA(方案 1 第 3 阶段第 5 步)

3. 专用设备

两台热循环仪(见第 11 步和第 12 步)

二、方法

1. 第一次杂交

(1)按照下面的顺序,将每个检测者样品与试剂混合。

(2)用 1 滴矿物油覆盖样品,并短暂离心。

(3)将样品在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

(4)根据样品类型,按照下面列出的时间将样品在 68°C 温育,然后立即进入第二次杂交。



本方案使用 15ng 连接的检测 DNA 和 450ng 驱动 DNAa 如果得要不同的消减效率,可以改变驱动者和

检测者的比例。

2. 第二次杂交

(9)(原文无 5~8 步—译者注)对每个实验的驱动 DNA, 重复下面步骤。



将下面的试剂,加至灭菌的 0.5 ml(原文为 1ul。一译者改)离心管中。

(10)从混合物中取 1ul, 加至 0.5 ml 离心管中,并加 1 滴矿物油覆盖。

(11)在热循环仪中 98°C 温育 1.5 min。

(12)将刚刚变性的驱动者离心管取出,立即放入另一台已稳定在 68°C 的热循环仪中。
使用另一台热循环仪(或另一个 block) 可以确保样品的迅速降温。

(13)然后,按照同样的顺序,依次加入已杂交的样品 1-1 和 1-2(来自第一次杂交)。
这样确保在刚变性的驱动 DNA 过董的情况下,两个杂交样品漫合。

(14)将杂交反应液在 68°C 温育过夜。

(15)加入 100ul 稀释缓冲液,并吹吸混匀。

(16)在热循环仪中 72°C 温育 7 min。

(17)在-20°C 保存杂交反应液。


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