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PCR技术

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR

2024-05-13 PCR技术 加入收藏
简介序列特异性寡核苷酸多态性 PCR,英文名是 PCR-sequence specific oligonucleotide polymorphism, PCR-

简介

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR,英文名是 PCR-sequence specific oligonucleotide polymorphism, PCR-SSOP,是可以采用一对引物扩增所有 HLA-A2 特异性抗原,用 23 个探针和扩增产物杂交,探针用地高辛系统标记和检测,可以鉴定 A2 的 25 个等位基因,并在中国人群 HLA-AO2 等位基因的检测中进行应用,用 B 淋巴母细胞株作为阴性对照,同时与聚合酶链反应-序列特异性引物 (PCR-SSP) 方法比较,结果发现 PCR-SSOP 方法质控好、特异性强、敏感性高、费用低,并在对大样本量进行检测时具有快速可靠等优点。

原理

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 的基本原理:
由于生物种类具有多样性,每一个基因在同一座位上具有多种等位基因。因此可以根据在同一基因上存在的差别将某一生物分为不同的类型,进而在功能上对它们加以区分。序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 包括设计通用引物,在不同样品中扩增等位基因;然后,使用多个探针 (同位素标记或生物素等标记) 在特定的条件下进行杂交,探针是针对每一个类型的基因 (同一簇等位基因) 设计的;经过显色或曝光,利用人工或电脑软件判读实验结果。

用途

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 可用于主要组织相容性抗原的分型,常用于对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)的 A、B、DR 进行分型;还可以检测不同样品间的组织特异性,鉴别分类,并确定亲缘关系;进行基因检验,查找病因,提供精确配型。

材料与仪器

器材:PCR 扩增仪、自动印迹仪。

试剂:

①DNA 抽提试剂:

A. 白细胞裂解液 (white cell lysis buffer, WCLB) 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6),10 mmol/L EDTA (pH 8.0),50 mmol/L NaCl。

B. 红细胞裂解液 (red cell lysis buffer, RCLB) 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6),5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L NaCl。

C. 酚-氯仿-异戊醇抽提液 (phenol-chloroform-isoamylalcohol, PCI) 酚-氯仿-异戊醇体积比为 25:24:1。

D.10 mg/mL 蛋白酶 K -20℃ 贮存,10%SDS。

②PCR 试剂:

PCR 引物,Taq 酶,Taq 酶缓冲液,dNTP。

③电泳试剂:

上样缓冲液,TBE 缓冲液,溴化乙锭,琼脂糖,DNA 分子量标准。

④DNA 变性剂:

2mol/L NaOH-50 mmol/L EDTA,现用现配。

⑤探针标记试剂:

A.32P 标记探针试剂:

10×多聚核苷酸激酶缓冲液 (0.5mol/L Tris-HCl,pH 7.6,0.1mol/L MgCl2,50 mmol/L DTT),多聚核苷酸激酶,32P 标记的 ATP。

B.Dig-dUTP(digoxigenin-dUTP) 标记探针试剂:

0.05 mmol/L dATP (pH 6.5〜7.5),1nmol/ul Dig-dUTP,末端转移酶,10×末端转移酶缓冲液 (1.4 mmol/L 二甲胂酸钠,300 mmol/L Tris-HCl pH 7.2,25 mmol/L CoCl2),3mol/L 醋酸钠 (pH 6.0~7.0),70% 乙醇,20 mg/ml 糖原。

C.Dig-ddUTP 标记探针试剂:

10×末端转移酶缓冲液 (1.4 mmol/L 二甲胂酸钠,300 mmol/L Tris-HCl pH 7.2,10 mmol/L CoCl2),Dig-ll-ddUTP,末端转移酶 50U/ul。

⑥标记探针的杂交试剂:

A. 杂交缓冲液:

15% 甲醛,10% 50×Denhardt’s 溶液 (10 g 聚蔗糖 Ficoll,10 g 聚乙烯吡咯烷酮,10 g 牛血清白蛋白 V,加 ddH2O 至 1000 ml),5×SSPE(0.15mol/L NaC,0.05mol/L NaH2PO4·7 H2O,5 mmol/L EDTA,pH 7.4),1% SDS,5% 硫酸葡聚糖,0.2 mg/mL ssDNA。

B. 洗涤缓冲液:

3mol/L 四甲基氯化铵 (tetramethylammonium chloride, TMAC),50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,2 mmol/L EDTA,0.1% SDS。

⑦地高辛标记探针普通检测方法 (不用 TMAC) 试剂:

50×Denhardt's (1% 聚乙烯吡咯烷酮,1% 聚蔗糖,1% BSA) 过滤除菌,-20℃ 贮存。

0.5mol/L EDTA (pH 8.0),20×SSPE (3mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4,0.02mol/L EDTA pH 7.4),1% N-十二烷肌酸钠,10% SDS,2mol/L 马来酸,1mol/L MgCl2,1mol/L Tris-HCl (pH 9.5),4mol/L NaCl,4mol/L NaOH,4×缓冲液 1 (0.4mol/L 马来酸,0.6mol/L NaCl,pH 7.5),5% 封闭液 [1000 mL 溶液中含有:0.1mol/L 马来酸,0.15mol/L NaCl,pH 7.5,50 g 封闭液 (Boehringer-Mannheim, Cat#1096-17),65℃ 加热 20 min,分装,4℃ 贮存]。

杂交液:2% 封闭液,6×SSPE,5×Denharts,0.1% N-十二烷肌酸钠,0.02% SDS。

洗涤液:冷洗液 (2×SSPE,0.1% SDS),热洗液 (5×SSPE,0.1% SDS)。

缓冲液 3:(0.1mol/L Tris-HCl,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2,pH 9.5)。
碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体。

⑧地高辛标记探针化学发光法检测试剂 (用 TMAC):

5 mg/ml 鮭精 DNA(70℃ 加热 1 h 后,振荡 1 min 剪切 DNA),50×Denhardt's 溶液,10% SDS,5mol/L NaCl,TN 缓冲液 (0.1mol/L Tris-HCl pH 7.5,0.,15mol/L NaCl,TNM 缓冲液 (0.1mol/L Tris-HCl pH 9.5,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L MgCl2),20×SSPE(3.0mol/L NaCl,0.2mol/L NaH2PO4·7 H2O,20 mmol/L EDTA,pH 7.4),CSPD(50 mL/瓶,Boehringer-Mannheim,Cat#755633),抗地高辛抗体。

杂交液:330 mL 20×SSPE,100 mL 50×Denhardts,1.0 g 肌氨酸,2 mL 10% SDS,20 mL 5 mg/ml 鲑精 DNA,加水至 200 mL。

S/S 洗液 (2×SSPE,0.1% SDS),TMAC 洗液 [500 mL 5mol/L TMA C(sigma,Cat#T- 3411),200 mL dH2O,41.7 mL 1mol/L Tris-HCl pH 7.5,8.3 mL 0.5mol/L EDTA,83.3 mL 10% SDS]。

步骤

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 的基本过程可分为如下几步:

(一)流程一

制备模板:
A. 新鲜的外周血:
从每个个体中抽取 10 mL 外周血,加入 2 mL 5% EDTA (pH 7.4) 混合均匀。1500r/min 离心 5 min,移去上层的血清,注意不要触及白细胞层。收集浅黄色层转移到一个新的离心管中,加入 10 mL RCLB,混合均匀,1500r/min 离心 10 min。弃掉上清,用 3 ml WCLB 重悬沉淀,加入 50ul 10% SDS 和 50ul 蛋白酶 K,轻轻摇动(50r/min),42〜50°C 过夜。
B. 冻存的外周血:
收集去除血清后的浅黄色层,-80℃ 保存。使用时迅速将之融化后,加入 10 mL RCLB,其它操作同上文。
C. 细胞系和冻存的淋巴细胞:
离心收集 (20〜50)×106 个细胞至 15 mL 离心管中,加入 3 mL 的 WCLB,然后加入 50ul 10% SDS 和 50ul 蛋白酶 K,孵育 3 h 或 42〜50°C 过夜。
D. 酚-氯仿抽提:
在用上述方法制备的样品中加入 3 mLPCL 完全混匀后离心,取上清转移 、至新的离心管中,用 PCI 进行二次抽提,再用氯仿-异戊醇 (24:1) 抽提一次,离心收集上清。
E. 异丙醇沉淀:
加入 60ul 5mol/L NaCl,再加入 0.6 倍体积 100% 异丙醇后轻轻摇动,直到沉淀产生,离心收集沉淀,用 70% 的乙醇漂洗三次,真空抽干,加入 TE 溶解,调整 DNA 的浓度至 100ug/ul,-20℃ 贮存备用。

(二)流程二

PCR 扩增基因:
A.PCR 扩增基因条件:
根据所要扩增的基因设计引物,计算退火温度及延伸时间。
B. 电泳检测结果:
选择合适的琼脂糖凝胶浓度,以 TBE 为缓冲液分离 PCR 样品。用溴化乙锭染色,检测扩增结果。

(三)流程三

印迹的设计:
每一次印迹应包括能与检测试剂杂交的参照 DNA 和不能与检测试剂杂交的参照 DNA,另外应设立一个阳性检测对照孔,该阳性检测对照的加入量应调节到阳性 SSOP 的结果能显示出来。

(四)流程四

印迹的步骤:
①将扩增产物从 4℃ 中取出,37℃ 温浴 30 min,同时将变性剂 2mol/L NaOH-50 mmol/L EDTA 进行温浴。之后以左上角 A 行 1 列为基准放置滴定板,确保样品能点在正确的位置。自动印迹仪的最大加样量为 30ul。
②用排枪加入 18ul 预热的变性剂,反复吹打三次,室温放置 30 min。
③在 A1 孔中加入 100ul 阳性对照,在进行印迹的过程中用镊子轻轻放置尼龙膜,不能折叠,不能用手触摸,除溶液板和印迹仪外不能使其接触任何东西。
④设置印迹仪至 86ul,从微量滴定板上样,然后再用变性剂将印迹仪的孔中液体补满,将膜逐一地放在滴定板下,每张膜上滴定 15ul,检查膜上是否有空白点,如有用手工填充。
⑤将膜放在一张 Whatman 3 MM 的滤纸上干燥 5 min。
⑥放一张用双蒸水浸湿的 3 MM 滤纸在紫外连接层上,将膜上带有 DNA 的一侧朝向紫外连接层,使用自动胶联程序将 DNA 胶联到膜上,大约需要 30s。
⑦将膜裹在塑料袋中,有 DNA 的一面不能褶皱,不能重叠,不能有气泡。保存在 4℃。
⑨清洗自动标记仪:
用 2% 的漂白液充满注射器 3 min,然后用双蒸水冲洗 5 次,将此循环重复 5 次。

(五)流程五

标记引物:
A. 用 32P 来标记引物:
反应体系:
引物10pmol[γ-32P] ATP15uCi
10×多核苷酸激酶缓冲液1.5ul加 H2O 至15ul
T4 多核苷酸激酶5U

37°C 孵育 30 min,立即使用;或加入 1ul 0.5mol/L EDTA,备用。
B. 用带有地高辛标记的 dUTP 来标记引物:
反应体系:
5×末端转移酶缓冲液24uldigoxigen-dUTP10.5ul
末端转移酶3ul (75U)SSOP 引物4ul (300pmol)
25 mmol/L CoCl26.3ul加 H2O 至120ul
0.05 mmol/L dATP10.5ul

混合均匀,37℃ 放置 15 min。
加入预置-20℃ 的 6ul 糖原,75ul 3mol/L 醋酸钠,600ul (-20℃) 100% 乙醇,振荡混合,然后高速离心 10s,冰上放置 10 min,4℃ 15000r/min 离心 30 min。
弃掉乙醇,加入 800ul 以 70% 乙醇洗涤一次,真空干燥。用 285ul 去离子水溶解,将标记好的引物分成小份,-20℃ 保存备用。
C. 用带有地高辛标记的 ddUTP 标记引物:
反应体系:
SSOP 引物40pmol25 mmol/L CoCl26ul
5×末端转移酶缓冲液24uldig-11-ddUTP(1nmol/ul)4ul
末端转移酶2ul(100U)加入 dH2O44ul
37°C 放置 60 min,中间轻轻混合 1〜2 次,立即应用或-20°C 保存。

(六)流程六

32P 标记引物的杂交、洗涤和检测:
①32P 标记引物的杂交:
将印迹的膜放在杂交盘中,使用同种探针的杂交膜可以放在一起,中间加上一层网状隔层,用 2×的 SSC 将膜浸润,弃掉废液。
按照每张膜的大小加入杂交液(0.1 mL/cm2),每张膜的大小约为 8 cmX12 cm,因此加入 8〜10 ml 即可(如用两张膜应将杂交液加倍)。在 42°C 杂交炉内最少进行预杂交 1 h。
加入带有放射性标记的探针,每毫升杂交液加入 1ul 探针,在 42℃ 继续杂交 2 h。
②32P 标记引物的洗涤:
弃掉杂交液,加入 20~30 mL 2×SSC 到杂交盘中,室温均匀摇动 5 min。
将杂交膜取出,放入预热的洗涤液(59〜60°C)中,在此步骤中不同探针杂交的膜可以放在同一个杂交盘中进行洗涤,洗涤时间在 25 min,最好不要超过 30 min,重复一次。
将膜从洗涤液中拿出,用双蒸水洗涤一次,自然风干。
③32P 标记引物的自显影:
将膜放在 Whatman 3 MM 滤纸上去掉多余的液体,将膜放入塑料袋中,用胶带封闭。在室温下,暴露在加增感屏的 X 射线胶片上感光 1〜5 h,直到有清晰的信号产生。

(七)流程七

地高辛标记探针的杂交、洗涤和检测(不用 TMAC):
①杂交前将 Denhardts 试剂放入 4℃ 融化,备用。5×SSPE/0.1% SDS 洗液需要提前预热 1 h,每次洗涤的用量大约为 200 mL。
②将膜卷成圆筒状,每个杂交瓶中放置两张膜。其中一张膜的 DNA 面朝向玻璃瓶的内侧,另一张的 DNA 面朝向玻璃瓶的外侧,将杂交瓶做上标记。
③加上 20 mL 新配制的杂交液(每张膜用 10 mL),拧紧盖子,放入预热的杂交炉中(45℃),预杂交 1 h。
④在孵育结束前,将探针从-20℃ 取出,融化至室温,轻轻混匀,13000r/min 离心 5s。
⑤加入适量的探针到含有 20 mL 杂交液的离心管中,预热,拧紧盖子,混匀。
⑥弃掉步骤③中的杂交液,加入步骤⑤中带有地高辛标记的探针,盖上盖子,在 45℃ 杂交炉中继续杂交 1 h。
⑦弃掉杂交液,在杂交瓶中加入 100 mL 预热的 2×SSPE/0.1% SDS 溶液,然后放入 25℃ 杂交炉中孵育 10 min。在此步骤中要保证温度的恒定,此步骤重复一次。
⑧将杂交瓶取出,拧开盖子,将膜用镊子夹出,放入预热的 200 mL 5×SSPE/0.1% SDS 的溶液中,两张膜具有 DNA 的面要背对背放置,在杂交炉中轻轻摇动 40 min。在此期间要注意杂交炉内的温度上下幅度不能超过 2℃,如超过此次杂交将作废。
⑩杂交完毕后,将膜取出风干,用锡纸包住,可先放置 4℃,准备显色。
⑪用洗涤液将杂交完毕的膜或从 4℃ 取出的膜洗涤两次,每次 15 min,轻轻摇动。
⑫将膜(1〜2 张)转移至 200 mL 缓冲液 3 中,摇动 5 min。用缓冲液 3 以 1:100 稀释 CSPD。然后取 20 mL 加入到杂交袋中,将两张膜背对背放好,用锡纸包住,室温下摇动 5 min。
⑬轻轻将膜移出袋子,将 CSPD 溶液弃掉,重新加入 CSPD,重复操作五次。
⑭用 X 射线胶片进行感光,要覆盖两层感光片,曝光约 5 min,检査感光片上的密度。

(八)流程八

地高辛标记探针的杂交、洗涤和检测(用 TMAC):
①从冰箱中取出带有单链 DNA 的膜,并用黑色笔在 DNA 面做上标记。用 2×SSPE 将膜浸湿,放入杂交管中,将带有 DNA 的一侧朝向管内。一个杂交管中最多可以放置三张膜。如杂交管中只有一张膜,需向杂交管中加入 7 mL 在 45℃ 预热 30 min 的杂交液,如杂交管中有三张膜,需加入 20 mL 杂交液。
②将含有 4ul 地高辛标记的探针的 1 mL 杂交液,加到上述杂交管中,在 45℃ 的杂交炉中杂交 60 min。
③弃掉杂交液,根据不同探针进行不同条件洗脱。首先加入 30 mL TMAC 洗涤液,室温下洗涤 10 min,弃掉,再加入 30 mL TMAC 在 51〜60°C,(洗脱温度取决于探针)洗涤 20 min,弃掉。然后加入 30 mL 的 S/S 洗涤液 51〜60°C 洗涤 10 min,弃掉。再加入 30 mL S/S 洗涤液,室温下洗涤 10 min,弃掉。
④加入 7 mL TN+2% 封闭液,在室温下进行预杂交 30 min,弃掉。然后加入 1.5ul 抗地高辛抗体到 TN+2% 封闭液,继续杂交 30 min。
⑤倾掉 TN+2% 封闭液+抗体,加入 100 mL TN 溶液,在室温下轻轻摇动 15 min。重复此操作一次。
⑥从杂交管中将膜移出,放入托盘中并加入 50 mL TNM 溶液,至少放置 1 min。
⑦在没有可见光和荧光的操作台上尽量使膜上多余的 TNM 溶液滴尽,然后将膜全部放入装有 CSPD 溶液的塑料盘中,孵育 1 min。
⑧滴尽膜上多余的 CSPD 溶液,将膜放入带有 X 射线的胶片盒中,37℃ 放置 30 min。
⑨在黑暗中打开盒,取一张 X 射线胶片放在膜上,关上盒盖,显影 15s〜3 min。记下胶片的 曝光时间、探针名称、时间等。
注意事项:

将 TMAC 废液存放在一个有利于环保的容器中。

注意事项

1.DNA 样品制备

制备高质量的 DNA 样品对于 PCR-SSOP 是至关重要的。如果使用全血应在抽取样品后 2〜3d 内提取 DNA,样品应放在室温下保存。如果不能立即抽提,应将样品放在-70〜-20°C。全血样品冰冻后可放置一年时间。

2.PCR 反应

选择引物要根据具体情况和相关资料来设计;扩增时的反应条件也要根据具体情况而定,不能一概而论。

3. 杂交、洗涤和检测

在杂交过程中杂交的温度取决于探针,不同的探针冗值不同,杂交所需温度不同。
在杂交中必须设立阴性和阳性对照,在显影的过程中,注意阴性和阳性的变化,每隔 10 min 要观察一次,保证阴性对照不显色或颜色很淡。
另外假阴性有可能是由于每个点上的 DNA 量太少的缘故造成的,这就需要 PCR 扩增时要达到一定的量。另外探针的质量、杂交的温度都有可能影响结果的判定。需要在实验过程中不断地摸索适宜条件。

4. 设立对照

(1)检测扩增 DNA 污染时的对照

检测 DNA 污染的阴性对照是在扩增 DNA 时除不加模板之外的其它条件均与扩增的条件一致,杂交时也要用相同的引物,这样可以检测到由于外源 DNA 的污染带来的假阳性现象。

(2)扩增特异性的对照

高质量的 DNA 才能用来杂交检测。在实验过程中必须设立一个阴性对照以检测扩增的特异性,对照模板 DNA 应不具有被检测 DNA 的等位基因,但必须是基因组 DNA,因为克隆的片段不能真实反映对照的特异性。在杂交时同样用相同的探针来鉴别扩增的特异性。所有的 PCR 产物都必须进行凝胶电泳检测以确定产物的大小和质量。

(3)探针特异性对照

阳性对照 DNA 必须携带能和每一个探针杂交的已知等位基因。如果可能,推荐使用的参照细胞应具有纯合的待检测座位,这样可以简化杂交过程中的影响因素。每个探针都应该设置一个不包括该等位基因的阴性对照。如果一个给定的 SSOP 仅有一个核甘酸与特定序列错配,那么阴性对照细胞也应该包括这一特殊序列。每一次杂交都应该包括这些对照来指导探针的特异性,而杂交的底物应是制备的基因组 DNA。

(4)DNA 定量对照

对于同一探针杂交的样品,每一张膜上都要设置变性 DNA 的定量对照。

(5)设置阳性检测对照

加入阳性对照能够检测系统是否正常工作,例如用随机加入标记地高辛的 dUTP 的 DNA 作为检测 DNA,此样品可以和抗地高辛抗体直接反应产生阳性信号。


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