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序列特异性寡核苷酸多态性 PCR

2024-05-13 PCR技术加入收藏

简介序列特异性寡核苷酸多态性 PCR，英文名是 PCR-sequence specific oligonucleotide polymorphism, PCR-

简介

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR，英文名是 PCR-sequence specific oligonucleotide polymorphism, PCR-SSOP，是可以采用一对引物扩增所有 HLA-A2 特异性抗原，用 23 个探针和扩增产物杂交，探针用地高辛系统标记和检测，可以鉴定 A2 的 25 个等位基因，并在中国人群 HLA-AO2 等位基因的检测中进行应用，用 B 淋巴母细胞株作为阴性对照，同时与聚合酶链反应-序列特异性引物 (PCR-SSP) 方法比较，结果发现 PCR-SSOP 方法质控好、特异性强、敏感性高、费用低，并在对大样本量进行检测时具有快速可靠等优点。

原理

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 的基本原理：
由于生物种类具有多样性，每一个基因在同一座位上具有多种等位基因。因此可以根据在同一基因上存在的差别将某一生物分为不同的类型，进而在功能上对它们加以区分。序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 包括设计通用引物，在不同样品中扩增等位基因；然后，使用多个探针 (同位素标记或生物素等标记) 在特定的条件下进行杂交，探针是针对每一个类型的基因 (同一簇等位基因) 设计的；经过显色或曝光，利用人工或电脑软件判读实验结果。

用途

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 可用于主要组织相容性抗原的分型，常用于对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）的 A、B、DR 进行分型；还可以检测不同样品间的组织特异性，鉴别分类，并确定亲缘关系；进行基因检验，查找病因，提供精确配型。

材料与仪器

器材：PCR 扩增仪、自动印迹仪。

试剂：

①DNA 抽提试剂：

A. 白细胞裂解液 (white cell lysis buffer, WCLB) 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，10 mmol/L EDTA (pH 8.0)，50 mmol/L NaCl。

B. 红细胞裂解液 (red cell lysis buffer, RCLB) 10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L NaCl。

C. 酚-氯仿-异戊醇抽提液 (phenol-chloroform-isoamylalcohol, PCI) 酚-氯仿-异戊醇体积比为 25：24：1。

D.10 mg/mL 蛋白酶 K -20℃ 贮存，10%SDS。

②PCR 试剂：

PCR 引物，Taq 酶，Taq 酶缓冲液，dNTP。

③电泳试剂：

上样缓冲液，TBE 缓冲液，溴化乙锭，琼脂糖，DNA 分子量标准。

④DNA 变性剂：

2mol/L NaOH-50 mmol/L EDTA，现用现配。

⑤探针标记试剂：

A.32P 标记探针试剂：

10×多聚核苷酸激酶缓冲液 (0.5mol/L Tris-HCl，pH 7.6，0.1mol/L MgCl2，50 mmol/L DTT)，多聚核苷酸激酶，32P 标记的 ATP。

B.Dig-dUTP(digoxigenin-dUTP) 标记探针试剂：

0.05 mmol/L dATP (pH 6.5〜7.5)，1nmol/ul Dig-dUTP，末端转移酶，10×末端转移酶缓冲液 (1.4 mmol/L 二甲胂酸钠，300 mmol/L Tris-HCl pH 7.2，25 mmol/L CoCl2)，3mol/L 醋酸钠 (pH 6.0～7.0)，70% 乙醇，20 mg/ml 糖原。

C.Dig-ddUTP 标记探针试剂：

10×末端转移酶缓冲液 (1.4 mmol/L 二甲胂酸钠，300 mmol/L Tris-HCl pH 7.2，10 mmol/L CoCl2)，Dig-ll-ddUTP，末端转移酶 50U/ul。

⑥标记探针的杂交试剂：

A. 杂交缓冲液：

15% 甲醛，10% 50×Denhardt’s 溶液 (10 g 聚蔗糖 Ficoll，10 g 聚乙烯吡咯烷酮，10 g 牛血清白蛋白 V，加 ddH2O 至 1000 ml)，5×SSPE(0.15mol/L NaC，0.05mol/L NaH2PO4·7 H2O，5 mmol/L EDTA，pH 7.4)，1% SDS，5% 硫酸葡聚糖，0.2 mg/mL ssDNA。

B. 洗涤缓冲液：

3mol/L 四甲基氯化铵 (tetramethylammonium chloride, TMAC)，50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，2 mmol/L EDTA，0.1% SDS。

⑦地高辛标记探针普通检测方法 (不用 TMAC) 试剂：

50×Denhardt's (1% 聚乙烯吡咯烷酮，1% 聚蔗糖，1% BSA) 过滤除菌，-20℃ 贮存。

0.5mol/L EDTA (pH 8.0)，20×SSPE (3mol/L NaCl，0.2mol/L NaH2PO4，0.02mol/L EDTA pH 7.4)，1% N-十二烷肌酸钠，10% SDS，2mol/L 马来酸，1mol/L MgCl2，1mol/L Tris-HCl (pH 9.5)，4mol/L NaCl，4mol/L NaOH，4×缓冲液 1 (0.4mol/L 马来酸，0.6mol/L NaCl，pH 7.5)，5% 封闭液［1000 mL 溶液中含有：0.1mol/L 马来酸，0.15mol/L NaCl，pH 7.5，50 g 封闭液 (Boehringer-Mannheim, Cat#1096-17)，65℃ 加热 20 min，分装，4℃ 贮存］。

杂交液：2% 封闭液，6×SSPE，5×Denharts，0.1% N-十二烷肌酸钠，0.02% SDS。

洗涤液：冷洗液 (2×SSPE，0.1% SDS)，热洗液 (5×SSPE，0.1% SDS)。

缓冲液 3：(0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2，pH 9.5)。
碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体。

⑧地高辛标记探针化学发光法检测试剂 (用 TMAC)：

5 mg/ml 鮭精 DNA(70℃ 加热 1 h 后，振荡 1 min 剪切 DNA)，50×Denhardt's 溶液，10% SDS，5mol/L NaCl，TN 缓冲液 (0.1mol/L Tris-HCl pH 7.5，0.,15mol/L NaCl，TNM 缓冲液 (0.1mol/L Tris-HCl pH 9.5，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2)，20×SSPE(3.0mol/L NaCl，0.2mol/L NaH2PO4·7 H2O，20 mmol/L EDTA，pH 7.4)，CSPD(50 mL/瓶，Boehringer-Mannheim，Cat#755633)，抗地高辛抗体。

杂交液：330 mL 20×SSPE，100 mL 50×Denhardts，1.0 g 肌氨酸，2 mL 10% SDS，20 mL 5 mg/ml 鲑精 DNA，加水至 200 mL。

S/S 洗液 (2×SSPE，0.1% SDS)，TMAC 洗液［500 mL 5mol/L TMA C(sigma，Cat#T- 3411)，200 mL dH2O，41.7 mL 1mol/L Tris-HCl pH 7.5，8.3 mL 0.5mol/L EDTA，83.3 mL 10% SDS］。

步骤

序列特异性寡核苷酸多态性 PCR 的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

制备模板：

A. 新鲜的外周血：

从每个个体中抽取 10 mL 外周血，加入 2 mL 5% EDTA (pH 7.4) 混合均匀。1500r/min 离心 5 min，移去上层的血清，注意不要触及白细胞层。收集浅黄色层转移到一个新的离心管中，加入 10 mL RCLB，混合均匀，1500r/min 离心 10 min。弃掉上清，用 3 ml WCLB 重悬沉淀，加入 50ul 10% SDS 和 50ul 蛋白酶 K，轻轻摇动（50r/min），42〜50°C 过夜。

B. 冻存的外周血：

收集去除血清后的浅黄色层，-80℃ 保存。使用时迅速将之融化后，加入 10 mL RCLB，其它操作同上文。

C. 细胞系和冻存的淋巴细胞：

离心收集 (20〜50)×106 个细胞至 15 mL 离心管中，加入 3 mL 的 WCLB，然后加入 50ul 10% SDS 和 50ul 蛋白酶 K，孵育 3 h 或 42〜50°C 过夜。

D. 酚-氯仿抽提：

在用上述方法制备的样品中加入 3 mLPCL 完全混匀后离心，取上清转移、至新的离心管中，用 PCI 进行二次抽提，再用氯仿-异戊醇 (24：1) 抽提一次，离心收集上清。

E. 异丙醇沉淀：

加入 60ul 5mol/L NaCl，再加入 0.6 倍体积 100% 异丙醇后轻轻摇动，直到沉淀产生，离心收集沉淀，用 70% 的乙醇漂洗三次，真空抽干，加入 TE 溶解，调整 DNA 的浓度至 100ug/ul，-20℃ 贮存备用。

（二）流程二

PCR 扩增基因：

A.PCR 扩增基因条件：

根据所要扩增的基因设计引物，计算退火温度及延伸时间。

B. 电泳检测结果：

选择合适的琼脂糖凝胶浓度，以 TBE 为缓冲液分离 PCR 样品。用溴化乙锭染色，检测扩增结果。

（三）流程三

印迹的设计：

每一次印迹应包括能与检测试剂杂交的参照 DNA 和不能与检测试剂杂交的参照 DNA，另外应设立一个阳性检测对照孔，该阳性检测对照的加入量应调节到阳性 SSOP 的结果能显示出来。

（四）流程四

印迹的步骤：

①将扩增产物从 4℃ 中取出，37℃ 温浴 30 min，同时将变性剂 2mol/L NaOH-50 mmol/L EDTA 进行温浴。之后以左上角 A 行 1 列为基准放置滴定板，确保样品能点在正确的位置。自动印迹仪的最大加样量为 30ul。

②用排枪加入 18ul 预热的变性剂，反复吹打三次，室温放置 30 min。

③在 A1 孔中加入 100ul 阳性对照，在进行印迹的过程中用镊子轻轻放置尼龙膜，不能折叠，不能用手触摸，除溶液板和印迹仪外不能使其接触任何东西。

④设置印迹仪至 86ul，从微量滴定板上样，然后再用变性剂将印迹仪的孔中液体补满，将膜逐一地放在滴定板下，每张膜上滴定 15ul，检查膜上是否有空白点，如有用手工填充。

⑤将膜放在一张 Whatman 3 MM 的滤纸上干燥 5 min。

⑥放一张用双蒸水浸湿的 3 MM 滤纸在紫外连接层上，将膜上带有 DNA 的一侧朝向紫外连接层，使用自动胶联程序将 DNA 胶联到膜上，大约需要 30s。

⑦将膜裹在塑料袋中，有 DNA 的一面不能褶皱，不能重叠，不能有气泡。保存在 4℃。

⑨清洗自动标记仪：

用 2% 的漂白液充满注射器 3 min，然后用双蒸水冲洗 5 次，将此循环重复 5 次。

（五）流程五

标记引物：

A. 用 32P 来标记引物：

反应体系：

引物	10pmol	[γ-32P] ATP	15uCi
10×多核苷酸激酶缓冲液	1.5ul	加 H2O 至	15ul
T4 多核苷酸激酶	5U

37°C 孵育 30 min，立即使用；或加入 1ul 0.5mol/L EDTA，备用。

B. 用带有地高辛标记的 dUTP 来标记引物：

反应体系：

5×末端转移酶缓冲液	24ul	digoxigen-dUTP	10.5ul
末端转移酶	3ul (75U)	SSOP 引物	4ul (300pmol)
25 mmol/L CoCl2	6.3ul	加 H2O 至	120ul
0.05 mmol/L dATP	10.5ul

混合均匀，37℃ 放置 15 min。

加入预置-20℃ 的 6ul 糖原，75ul 3mol/L 醋酸钠，600ul (-20℃) 100% 乙醇，振荡混合，然后高速离心 10s，冰上放置 10 min，4℃ 15000r/min 离心 30 min。

弃掉乙醇，加入 800ul 以 70% 乙醇洗涤一次，真空干燥。用 285ul 去离子水溶解，将标记好的引物分成小份，-20℃ 保存备用。

C. 用带有地高辛标记的 ddUTP 标记引物：

反应体系：

SSOP 引物	40pmol	25 mmol/L CoCl2	6ul
5×末端转移酶缓冲液	24ul	dig-11-ddUTP(1nmol/ul)	4ul
末端转移酶	2ul（100U）	加入 dH2O	44ul

37°C 放置 60 min，中间轻轻混合 1〜2 次，立即应用或-20°C 保存。

（六）流程六

32P 标记引物的杂交、洗涤和检测：

①32P 标记引物的杂交：

将印迹的膜放在杂交盘中，使用同种探针的杂交膜可以放在一起，中间加上一层网状隔层，用 2×的 SSC 将膜浸润，弃掉废液。

按照每张膜的大小加入杂交液（0.1 mL/cm2），每张膜的大小约为 8 cmX12 cm，因此加入 8〜10 ml 即可（如用两张膜应将杂交液加倍）。在 42°C 杂交炉内最少进行预杂交 1 h。

加入带有放射性标记的探针，每毫升杂交液加入 1ul 探针，在 42℃ 继续杂交 2 h。

②32P 标记引物的洗涤：

弃掉杂交液，加入 20~30 mL 2×SSC 到杂交盘中，室温均匀摇动 5 min。

将杂交膜取出，放入预热的洗涤液（59〜60°C）中，在此步骤中不同探针杂交的膜可以放在同一个杂交盘中进行洗涤，洗涤时间在 25 min，最好不要超过 30 min，重复一次。

将膜从洗涤液中拿出，用双蒸水洗涤一次，自然风干。

③32P 标记引物的自显影：

将膜放在 Whatman 3 MM 滤纸上去掉多余的液体，将膜放入塑料袋中，用胶带封闭。在室温下，暴露在加增感屏的 X 射线胶片上感光 1〜5 h，直到有清晰的信号产生。

（七）流程七

地高辛标记探针的杂交、洗涤和检测（不用 TMAC）：

①杂交前将 Denhardts 试剂放入 4℃ 融化，备用。5×SSPE/0.1% SDS 洗液需要提前预热 1 h，每次洗涤的用量大约为 200 mL。

②将膜卷成圆筒状，每个杂交瓶中放置两张膜。其中一张膜的 DNA 面朝向玻璃瓶的内侧，另一张的 DNA 面朝向玻璃瓶的外侧，将杂交瓶做上标记。

③加上 20 mL 新配制的杂交液（每张膜用 10 mL），拧紧盖子，放入预热的杂交炉中（45℃），预杂交 1 h。

④在孵育结束前，将探针从-20℃ 取出，融化至室温，轻轻混匀，13000r/min 离心 5s。

⑤加入适量的探针到含有 20 mL 杂交液的离心管中，预热，拧紧盖子，混匀。

⑥弃掉步骤③中的杂交液，加入步骤⑤中带有地高辛标记的探针，盖上盖子，在 45℃ 杂交炉中继续杂交 1 h。

⑦弃掉杂交液，在杂交瓶中加入 100 mL 预热的 2×SSPE/0.1% SDS 溶液，然后放入 25℃ 杂交炉中孵育 10 min。在此步骤中要保证温度的恒定，此步骤重复一次。

⑧将杂交瓶取出，拧开盖子，将膜用镊子夹出，放入预热的 200 mL 5×SSPE/0.1% SDS 的溶液中，两张膜具有 DNA 的面要背对背放置，在杂交炉中轻轻摇动 40 min。在此期间要注意杂交炉内的温度上下幅度不能超过 2℃，如超过此次杂交将作废。

⑩杂交完毕后，将膜取出风干，用锡纸包住，可先放置 4℃，准备显色。

⑪用洗涤液将杂交完毕的膜或从 4℃ 取出的膜洗涤两次，每次 15 min，轻轻摇动。

⑫将膜（1〜2 张）转移至 200 mL 缓冲液 3 中，摇动 5 min。用缓冲液 3 以 1：100 稀释 CSPD。然后取 20 mL 加入到杂交袋中，将两张膜背对背放好，用锡纸包住，室温下摇动 5 min。

⑬轻轻将膜移出袋子，将 CSPD 溶液弃掉，重新加入 CSPD，重复操作五次。

⑭用 X 射线胶片进行感光，要覆盖两层感光片，曝光约 5 min，检査感光片上的密度。

（八）流程八

地高辛标记探针的杂交、洗涤和检测（用 TMAC）：

①从冰箱中取出带有单链 DNA 的膜，并用黑色笔在 DNA 面做上标记。用 2×SSPE 将膜浸湿，放入杂交管中，将带有 DNA 的一侧朝向管内。一个杂交管中最多可以放置三张膜。如杂交管中只有一张膜，需向杂交管中加入 7 mL 在 45℃ 预热 30 min 的杂交液，如杂交管中有三张膜，需加入 20 mL 杂交液。

②将含有 4ul 地高辛标记的探针的 1 mL 杂交液，加到上述杂交管中，在 45℃ 的杂交炉中杂交 60 min。

③弃掉杂交液，根据不同探针进行不同条件洗脱。首先加入 30 mL TMAC 洗涤液，室温下洗涤 10 min，弃掉，再加入 30 mL TMAC 在 51〜60°C,（洗脱温度取决于探针）洗涤 20 min，弃掉。然后加入 30 mL 的 S/S 洗涤液 51〜60°C 洗涤 10 min，弃掉。再加入 30 mL S/S 洗涤液，室温下洗涤 10 min，弃掉。

④加入 7 mL TN+2% 封闭液，在室温下进行预杂交 30 min，弃掉。然后加入 1.5ul 抗地高辛抗体到 TN+2% 封闭液，继续杂交 30 min。

⑤倾掉 TN+2% 封闭液+抗体，加入 100 mL TN 溶液，在室温下轻轻摇动 15 min。重复此操作一次。

⑥从杂交管中将膜移出，放入托盘中并加入 50 mL TNM 溶液，至少放置 1 min。

⑦在没有可见光和荧光的操作台上尽量使膜上多余的 TNM 溶液滴尽，然后将膜全部放入装有 CSPD 溶液的塑料盘中，孵育 1 min。

⑧滴尽膜上多余的 CSPD 溶液，将膜放入带有 X 射线的胶片盒中，37℃ 放置 30 min。

⑨在黑暗中打开盒，取一张 X 射线胶片放在膜上，关上盒盖，显影 15s〜3 min。记下胶片的曝光时间、探针名称、时间等。

注意事项：

将 TMAC 废液存放在一个有利于环保的容器中。

注意事项

1.DNA 样品制备

制备高质量的 DNA 样品对于 PCR-SSOP 是至关重要的。如果使用全血应在抽取样品后 2〜3d 内提取 DNA，样品应放在室温下保存。如果不能立即抽提，应将样品放在-70〜-20°C。全血样品冰冻后可放置一年时间。

2.PCR 反应

选择引物要根据具体情况和相关资料来设计；扩增时的反应条件也要根据具体情况而定，不能一概而论。

3. 杂交、洗涤和检测

在杂交过程中杂交的温度取决于探针，不同的探针冗值不同，杂交所需温度不同。
在杂交中必须设立阴性和阳性对照，在显影的过程中，注意阴性和阳性的变化，每隔 10 min 要观察一次，保证阴性对照不显色或颜色很淡。
另外假阴性有可能是由于每个点上的 DNA 量太少的缘故造成的，这就需要 PCR 扩增时要达到一定的量。另外探针的质量、杂交的温度都有可能影响结果的判定。需要在实验过程中不断地摸索适宜条件。

4. 设立对照

（1）检测扩增 DNA 污染时的对照

检测 DNA 污染的阴性对照是在扩增 DNA 时除不加模板之外的其它条件均与扩增的条件一致，杂交时也要用相同的引物，这样可以检测到由于外源 DNA 的污染带来的假阳性现象。

（2）扩增特异性的对照

高质量的 DNA 才能用来杂交检测。在实验过程中必须设立一个阴性对照以检测扩增的特异性，对照模板 DNA 应不具有被检测 DNA 的等位基因，但必须是基因组 DNA，因为克隆的片段不能真实反映对照的特异性。在杂交时同样用相同的探针来鉴别扩增的特异性。所有的 PCR 产物都必须进行凝胶电泳检测以确定产物的大小和质量。

（3）探针特异性对照

阳性对照 DNA 必须携带能和每一个探针杂交的已知等位基因。如果可能，推荐使用的参照细胞应具有纯合的待检测座位，这样可以简化杂交过程中的影响因素。每个探针都应该设置一个不包括该等位基因的阴性对照。如果一个给定的 SSOP 仅有一个核甘酸与特定序列错配，那么阴性对照细胞也应该包括这一特殊序列。每一次杂交都应该包括这些对照来指导探针的特异性，而杂交的底物应是制备的基因组 DNA。

（4）DNA 定量对照

对于同一探针杂交的样品，每一张膜上都要设置变性 DNA 的定量对照。

（5）设置阳性检测对照

加入阳性对照能够检测系统是否正常工作，例如用随机加入标记地高辛的 dUTP 的 DNA 作为检测 DNA，此样品可以和抗地高辛抗体直接反应产生阳性信号。