降落PCR

降落 PCR 是 Dn 于 1991 年最早发明的指每一个(或 n 个)循环降低 1(或 nC)退火温度，直至达到一个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行 10 个左右的循环。据统计，正确和非正确退火温度之间的 1 差异将造成 FR 产物量的 4 倍差异，如果相差 5 就会产生 42(1024)倍的优势,因此相对于非正确产物，正确的产物可以得到富集。退火温度起始在高于计算的T值的 15 左右，在接下来的循环中。

退火温度以每次 12 逐渐降低，直到 T 值以下 5 当达到特异的引物模板结合的 T 值时，扩增就会开始。当退火温度降到非特异扩增发生的水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势,在剩余反应中特异产物优先扩增，从而产生单一的占主导地位的扩增产物。这种方法主要用于避免非特异 PCR 产物的出现，尤其是当使用复杂的基因组 DNA 模板,非特异的退火更容易发生时。

降落 PCR 中正确的产物得到富集，原理在于温度的升高提高了 PCR 扩增的特异性，但也提高了引物结合的难度，降低了扩增的效率，因此一开始先用高温扩增，保证扩增的严紧性，待目的基因的主度上升后，降低扩增的温度，提高扩增的效率(此时非特异的位点由于丰度低，无法和特异位点竞争)。但是，降落 PCR 无法改善扩增效率低的问题,一般用于在杂模板中提高扩增特异性。

把降落 PCR 与定量 PCR 结合起来，检测样品中的病原数量，敏感性好，精确度也高在 LarsenHI 等人的研究中,当他们使用退火温度为 50 的常规 PCR 程序时，得到的结果不尽如人意。后来改用了降落 PCR 的方法退火温度由65降到50(2~6个循环每个循环降低 1:7~11 个循环每个循环降低,然后在退火温度为 50 时 35 个循环。结果表明，使用降落 PCR 时，12 个样品全部检测为阳性;而同样条件下，使用常规PCR 程序 12 个样品中只有 7 份是阳性。

在 Seoml 等的工作中,他们试图设计一对引物去同时检测兰科植物中感染很广的两种w# cymbidium mosaic potexvirus(CymMV)Fl odontoglossum ringspot tobamovirus(ORSV)预计扩增 PCR 的片段分别是 534bp(CymMV)和290bp(ORSV),当使用标准 PCR 程序扩增时,退火温度为 55,但是 CymMV 的 534bp 片段的扩增效率远远高于 ORSV 的 290bp 片段 290bp 片段几乎看不见，可能是 CymMV 的这段序列(G+C)含量较高，有较高的退火结合温度。后来他们尝试了降落 PCR 的方法，起始温度分别为 504846 每个循环降低 0.5 共 30 个循环。

结果表明当起始退火温度为 48 时，电泳检测两条带的强度相似，产物比起标准 PCR 程序都有所增加。说明降低起始退火温度，更有利于引物与 ORSv 结合。但当降落 PCR 的起始退火温度降到 46 时，就出现了较多的非特异产物。因此，最后他们选择了起始退火温度为 48 的降落 PCR 降落 PCR 的另一个应用是在确定已知氨基酸序列肽的 DNA 序列。

具体过程如下:

使用两条与已知序列肽两末端可能配对的简并引物，需要知道一段长为 13 个氨基酸的肽段序列，5 和 3 引物各长 18 个碱基(6个氨基酸)，两者之间有一个碱基或更长的间隔，进行“touchdownPCR”。由这种方法将获得大量的产物，但因为由肽序列可以知道引物之间的确切距离，所以可以根据产物的大小来选择所需要的产物。

该方法的优点在于可以富集引物与模板正确配对的产物。如果克隆彬蔚和测序几个PCR产物,将可以确定肽的正确编码DNA序列，可用于设计进行杂交的寡核苷酸。该
技术特别适用于由Serlys和Arg(每个有6个密码子)构成的多肽。

基因样品 引物 去离子水 DNA 聚合酶 缓冲液 dNTP MgSO4(可选) 和 DMSO（可选）PCR

1.反应体积为 50 ul。

2.人 CD137 胞膜外区基因的 PCR 扩增体系：CD137-pCDNA3 质粒 4 ul，P1，P2各 0.5 umol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

3. hIgG1Fc 片段的 PCR 扩增体系：含人 hIgG1Fc 的 PGEM-T 质粒 4 ul，P3、P4各 0.4 umol/L，MgCl2 2 mmol/L，dNTP 0.4 mmol/L，Taq 5 U。

4. HBVDNA 多聚酶基因的 PCR 扩增体系：

（1）第一轮：HBVDNA 模板 4 ul，P5、P6 各 0.25 umol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。

（2）第二轮：取 5 倍稀释的第一轮 PCR 产物 4 ul 为模板，P7、P8 各0.25 umol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq 0.8 U。

5.分别在各灭菌 PCR 管加入上述各反应成分，100℃ 煮沸 5 min，立即冰浴 5 min，加入 TaqDNA 聚合酶，混匀，离心，PCR 程序如下：取 10 ul PCR 扩增产物，在 2% 或 3% 琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察扩增产物。

1.设置热循环仪程序。下面的时间表适用于所计算的 T 值为 60℃ 的情况。

循环号 变性 复性 延伸

1 、 94℃，1min 66℃，30s 72℃，1min
2 、94℃，1min 65℃，30s 72℃，1min
3 、94℃，1min 64℃，30s 72℃，1min
4 、94℃，1min 63℃，30s 72℃，1min
5 、94℃，1min 62℃，30s 72℃，1min
6 、94℃，1min 61℃，30s 72℃，1min
7 、94℃，1min 60℃，30s 72℃，1min
8 、94℃，1min 59℃，30s 72℃，1min
9 、94℃，lmin 58℃，30s 72℃，1min
10、94℃，1min 57℃，30s 72℃，1min
11、94℃，1min 56℃，30s 72℃，1min
12~27、94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min

2.建立一个方案 2 中描述的热启动 PCR。在方案 2 中的步骤 6，执行上面的时间表进行扩增反应。注意总循环数不要超过 30~35，否则会出现非特异性产物和/或引物二聚体。