双标记签的PCR扩增实验

实验方案 A 和 B

一、连接混合物的 PCR 扩增

1.加入 LoTE 使连接混合物的体积增至 20ul。

2.按 1% 浓度稀释连接混合物。

3.在 50ulPCR 反应中以 Iul 的 1% 稀释后的连接混合物作为模板：

4.最后，在 PCR 的反应中加入 1ul 稀释的连接混合物作为模板。

5.用下列条件来进行 PCR 扩增：

在进行 PCR 扩增后，在 12% 聚丙稀酰胺凝胶上电泳分析 IOul 的 PCR 混合物，用一个 IOul 的 ladder 作为标志，我们推荐用 Mini-PROTEANII 垂直电泳系统进行电泳 (BioRad)。

二、大量 PCR 的纯化（n=IOO)

1.在稀释的连接混合物大量地扩增之后（100XIOOul 的 PCR 反应)，在 100 ml 的烧杯中混合（混合体积为 10 ml 左右)。

2.50 ml 的 PB 缓冲液（QIAquickPCR 纯化试剂盒）于稀释的 PCR 混合物中，混匀。

3.向 16 个 QIAquick 柱中，每个加入 600ul。

4.在微量离心机中以 13000r/min 离心 45s。

5.移去过滤液并用同一柱重复 5 次，每次均加入稀释的 PCR 混合物 600ul。

6.在移去最后 1 次过滤液后，离心 1 次以去除所有的液体。

7.用 0.75 ml 缓冲液 PE 冲洗（QIAquickPCR 纯化试剂盒)。

8.以 13000r/min 在微量离心机中离心 45s。

9.弃去流过的液体，并再全速旋转 Imin 以去除所有的液体。

10.将此柱置入一干净的 1.5 ml 的 Eppendorf 试管中。

11.一个柱中加入 30ul 的洗脱缓冲液（QIAquickPCR 纯化试剂盒)。

12.在室温下放置 15 min。

13.以 13OOOr/min 在微量离心机中离心 Imin 以洗脱 DNA。

14.将 16 柱洗脱的 DNA 混合入一个试管中（总体积为 480ul)。