基于 PCR 的 DNA 文库筛选实验方法
材料与仪器PCR 混合物 PCR 引物寡核苷酸 杂交寡核苷酸 PCR 正对照 PCR 主要混合物 蒸馏水琼脂糖凝胶电泳设备步骤一、材料1. 缓冲液、溶液和试剂蒸
材料与仪器
PCR 混合物 PCR 引物寡核苷酸 杂交寡核苷酸 PCR 正对照 PCR 主要混合物 蒸馏水
琼脂糖凝胶电泳设备
琼脂糖凝胶电泳设备
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
蒸馏水
2. 酶和酶缓冲液
PCR 混合物（可以放在一起冰冻），对于 lml 反应，包括：200nmol 的各种 dNTP;1XVent 溶液或等价物；2.5umol 的 MgCl2；2nmol 的各引物
PCR 主要混合物（每个反应必须新鲜配置）：lulVent DNA 聚合酶或等价物；99ul 上述 PCR 混合物
3. 核酸和寡核苷酸
2 个 PCR 引物寡核苷酸
1 个杂交寡核苷酸
PCR 正对照：10ng 全基因组 DNA 或能产生阳性 PCR 信号的起始文库组分（见第 5 步）
4. 培养基
LB，1L 水中加入：10 g 蛋白胨、5 g 酵母抽提物、10 gNaCl, 用 NaOH 调节 pH 至 7.5SM,1L 水中加入：5.8 gNaCl、2 gMgS04、50 ml1mol/LTris-HCl(pH7.5)、5 ml2% 的明胶。
含10mmol/LMgSO4 的 LB
5. 特殊设备
琼脂糖凝胶电泳设备，包括溴化乙锭
6. 其他
96 孔板（CorningCostar)
聚酯封口膜（NalgeNuncInternational)
噬菌斑杂交所需材料
7. 载体和细菌菌株
用噬菌体载体构建的 DNA 库
用于扩增文库的细菌菌株
二、方法
在筛选 DNA 文库之前，需要测定几个参数来建立有效的实验条件。这些参数如下。
1.PCR 条件。用筛库的引物改变退火温度和循环次数，以得到最大量的特异产物。模板的来源可以是将要筛选的文库（106 个噬菌体顆粒）或者是 1ng 的全基因组 DNA。在PCR 过程中，噬菌体 DNA 释放作为模板。因此，在反应之前不需要提纯噬菌体 DNA。可以使用的典型引物应该产生 0.1~1.0kb 的产物（16~24 个核苷酸长度，50%G+C 含量）。如果需要（比如，当用与不同外显子配对、横跨一个大的内含子的引物时），目的序列可能比1kb 长，但产物的量可能会减少。
2. 确定文库中基因的丰度。用上面所建立的 PCR 条件，通过改变加入噬菌体的数目定量文库。能产生 PCR 产物的噬菌体的最小数目就是实验确定的该基因在文库中的丰度。对于一个插入片段平均为 20kb 的基因组文库来说，要有大于 105 的复杂度，以确保目的基因至少出现一次。对一个高复杂度的典型文库来说，用 104~106 个噬菌体做模板，可以显示基因在库中的丰度。加入的含有一个或两个目的基因拷贝的噬菌体的数目，应该用作文库筛选。
一旦确定了 PCR 条件和基因的丰度，就可以按照如下方法进行文库筛选。
1. 取 0.5 ml 新鲜的、在 LB 中过夜培养的细菌培养物，与 0.5 mlSM 混合，加入含有文库的噬菌体，室温温育 20 min。
2. 加入 20 ml 含 10 mmol/LMgSO4 的 LB，按 8X8 矩阵分装到 96 孔板中，每孔 100ul。将板用聚酯封口膜密封，37°C 225r/min 振荡培养 5~6 h, 对噬菌体进行扩增。扩增之后，噬菌体的浓度应该增加到大概 109 个/ml。大概有 1/3 的培养物能被均分进 96 孔板，在计算步骤 1 的加入噬菌体数时应当考虑到这一点。
3. 将一排或一列 8 个孔中的噬菌体（每孔 25ul) 用多孔移液器混合（参看讨论部分的可变样式）。在这一步中，当取掉封口膜和移液时，一定要特别小心，以避免样品交叉污染。如果想避免交叉污染，可以将板子短暂离心，以帮助清除封口膜上的液体。用聚酯封口膜将板子重新封闭，在 4°C 可以保存 1 个月。
4. 用蒸馏水按 1:1 稀释噬菌体，现在噬菌体就可以用作 PCR 模板了。
5. 在 24.5ul PCR 主要混合物中加入 0.5ul 的模板（噬菌体），用上面建立的 PCR 条件进行 PCR。每个实验需要有一个负对照（不加模板）和一个正对照（即能产生阳性信号的10ng 的总基因组 DNA 或一小份的起始文库）。
6. 通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。用溴化乙锭染胶并拍照（Sambrook and Russell2001)。
7.70°C 其空干燥凝胶，变性 DNA, 然后将寡核苷酸探针（末端用 32P 标记）用标准的DNA 杂交条件与干燥的凝胶直接进行杂交，洗涤，然后放射性自显影 [这一步的技术细节可以参看 Israel(1993)]。用溴化乙锭染色很容易就能看到特异的 PCR 产物时，这一步是可以选做的，下面会有讨论。也可以用标准技术将 DNA 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上后再进行杂交。
笫 6 步和/或第 7 步東得的数据应该能鉴定出含有目的基因的亚库（见讨论部分笫一轮的筛选现在就完成了，与起始文库相比阳性亚库中的基因已经被富集了，后续的筛选循环是 1~7 步的重复，在扩增的亚库噬菌体定量之后就可以进行。
8. 通过噬菌斑法确定阳性孔中的噬菌体的量（Sambrook and Russell2001)。
9. 用约为上一轮数量 1/30 的噬菌体侵染细菌，开始下一轮的筛选。
10. 重复 2~9 步。
1. 缓冲液、溶液和试剂
蒸馏水
2. 酶和酶缓冲液
PCR 混合物（可以放在一起冰冻），对于 lml 反应，包括：200nmol 的各种 dNTP;1XVent 溶液或等价物；2.5umol 的 MgCl2；2nmol 的各引物
PCR 主要混合物（每个反应必须新鲜配置）：lulVent DNA 聚合酶或等价物；99ul 上述 PCR 混合物
3. 核酸和寡核苷酸
2 个 PCR 引物寡核苷酸
1 个杂交寡核苷酸
PCR 正对照：10ng 全基因组 DNA 或能产生阳性 PCR 信号的起始文库组分（见第 5 步）
4. 培养基
LB，1L 水中加入：10 g 蛋白胨、5 g 酵母抽提物、10 gNaCl, 用 NaOH 调节 pH 至 7.5SM,1L 水中加入：5.8 gNaCl、2 gMgS04、50 ml1mol/LTris-HCl(pH7.5)、5 ml2% 的明胶。
含10mmol/LMgSO4 的 LB
5. 特殊设备
琼脂糖凝胶电泳设备，包括溴化乙锭
6. 其他
96 孔板（CorningCostar)
聚酯封口膜（NalgeNuncInternational)
噬菌斑杂交所需材料
7. 载体和细菌菌株
用噬菌体载体构建的 DNA 库
用于扩增文库的细菌菌株
二、方法
在筛选 DNA 文库之前，需要测定几个参数来建立有效的实验条件。这些参数如下。
1.PCR 条件。用筛库的引物改变退火温度和循环次数，以得到最大量的特异产物。模板的来源可以是将要筛选的文库（106 个噬菌体顆粒）或者是 1ng 的全基因组 DNA。在PCR 过程中，噬菌体 DNA 释放作为模板。因此，在反应之前不需要提纯噬菌体 DNA。可以使用的典型引物应该产生 0.1~1.0kb 的产物（16~24 个核苷酸长度，50%G+C 含量）。如果需要（比如，当用与不同外显子配对、横跨一个大的内含子的引物时），目的序列可能比1kb 长，但产物的量可能会减少。
2. 确定文库中基因的丰度。用上面所建立的 PCR 条件，通过改变加入噬菌体的数目定量文库。能产生 PCR 产物的噬菌体的最小数目就是实验确定的该基因在文库中的丰度。对于一个插入片段平均为 20kb 的基因组文库来说，要有大于 105 的复杂度，以确保目的基因至少出现一次。对一个高复杂度的典型文库来说，用 104~106 个噬菌体做模板，可以显示基因在库中的丰度。加入的含有一个或两个目的基因拷贝的噬菌体的数目，应该用作文库筛选。
一旦确定了 PCR 条件和基因的丰度，就可以按照如下方法进行文库筛选。
1. 取 0.5 ml 新鲜的、在 LB 中过夜培养的细菌培养物，与 0.5 mlSM 混合，加入含有文库的噬菌体，室温温育 20 min。
2. 加入 20 ml 含 10 mmol/LMgSO4 的 LB，按 8X8 矩阵分装到 96 孔板中，每孔 100ul。将板用聚酯封口膜密封，37°C 225r/min 振荡培养 5~6 h, 对噬菌体进行扩增。扩增之后，噬菌体的浓度应该增加到大概 109 个/ml。大概有 1/3 的培养物能被均分进 96 孔板，在计算步骤 1 的加入噬菌体数时应当考虑到这一点。
3. 将一排或一列 8 个孔中的噬菌体（每孔 25ul) 用多孔移液器混合（参看讨论部分的可变样式）。在这一步中，当取掉封口膜和移液时，一定要特别小心，以避免样品交叉污染。如果想避免交叉污染，可以将板子短暂离心，以帮助清除封口膜上的液体。用聚酯封口膜将板子重新封闭，在 4°C 可以保存 1 个月。
4. 用蒸馏水按 1:1 稀释噬菌体，现在噬菌体就可以用作 PCR 模板了。
5. 在 24.5ul PCR 主要混合物中加入 0.5ul 的模板（噬菌体），用上面建立的 PCR 条件进行 PCR。每个实验需要有一个负对照（不加模板）和一个正对照（即能产生阳性信号的10ng 的总基因组 DNA 或一小份的起始文库）。
6. 通过琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。用溴化乙锭染胶并拍照（Sambrook and Russell2001)。
7.70°C 其空干燥凝胶，变性 DNA, 然后将寡核苷酸探针（末端用 32P 标记）用标准的DNA 杂交条件与干燥的凝胶直接进行杂交，洗涤，然后放射性自显影 [这一步的技术细节可以参看 Israel(1993)]。用溴化乙锭染色很容易就能看到特异的 PCR 产物时，这一步是可以选做的，下面会有讨论。也可以用标准技术将 DNA 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上后再进行杂交。
笫 6 步和/或第 7 步東得的数据应该能鉴定出含有目的基因的亚库（见讨论部分笫一轮的筛选现在就完成了，与起始文库相比阳性亚库中的基因已经被富集了，后续的筛选循环是 1~7 步的重复，在扩增的亚库噬菌体定量之后就可以进行。
8. 通过噬菌斑法确定阳性孔中的噬菌体的量（Sambrook and Russell2001)。
9. 用约为上一轮数量 1/30 的噬菌体侵染细菌，开始下一轮的筛选。
10. 重复 2~9 步。
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