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PCR技术

重叠延伸 PCR基本方案

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
原理重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产

原理

重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。

材料与仪器

基因样品
PCR扩增酶 扩增酶Buffer dNTP 引物
PCR仪

步骤

1.  以引物a/b进行pcr1。

2.  以引物c/d进行pcr2。

3.  引物b/c中引入了需要的限制性位点。

4.  混合二者pcr产物,混合以前最好回收一下。

5.  进行pcr延伸反应,只有右面这个可以延伸。

6.  以延伸反应的产物为模板,以a/d为引物进行pcr。

7.  产物即为所需最终产物。

注意事项

尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因,样品间的交叉污染也是原因之一。因此,不仅要在进行扩增反应是谨慎认真,在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意:


1. 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;


2. 使用一次性吸头,严禁与PCR产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;


3. 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;


4. 操作多份样品时,制备反应混合液,先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好,然后分装,这样即可以减少操作,避免污染,又可以增加反应的精确度;


5. 最后加入反应模板,加入后盖紧反应管;


6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;


7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少PCR操作过程中加样器应该专用,不能交叉使用,尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区;


8. 重复实验,验证结果,慎下结论。 



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