实时定量PCR技术在恶性肿瘤诊断中的应用

背景：生物科学和有关技术的发展为恶性肿瘤的诊断和治疗提供了分子学依据。当前，外科病理学主要依据肿瘤的解剖特点（如：转移瘤）和组织病理学对恶性肿瘤分类。微阵列连同聚类分析揭示了肿瘤分子的差异多样性，靠这一点有望建立一个新的与预后有关的分类方法，更重要的是，对疗效有重要的意义。病理学上的挑战将成为常规临床应用分子学分类的发展和补充。

方法：本文重点放在临床实验室中用以DNA为基础的PCR技术来了解实体肿瘤的概况，并讨论这种技术的意义、发展和可能性。

内容：分子标志物可以为我们提供准确的预后和机体对治疗的反应、耐药性和毒副作用。由于与肿瘤恶性有关的基因改变的多样性，要得到肿瘤完整的特征，需要进行各种实验。一些新的肿瘤分子学分类是以基因表达为基础的，需要在标本的处理过程中保持RNA的完整。更多稳定的分子标志物（如DNA和蛋白）在临床实验室中广泛应用。实时定量PCR可以测定基因的重复和缺失。另外，PCR后立即进行熔化曲线分析可以辨别很小的突变和甚至单个碱基的变化。这种技术变得越来越简单和快速并且可以进行多重测量。进行肿瘤标志物分析，实时定量PCR技术无疑是一种有利的选择。

总结：将最近在肿瘤学方面的发现介绍到临床应用中是很有必要的。这需要客观的、完善的、合算的分子技术用于临床试验，最终用于常规检测。实时定量PCR在实验室对肿瘤特性研究的应用前景诱人。

现在大部分人类基因组的序列可获得，可用于了解、定性和治疗复杂疾病如恶性肿瘤。对肿瘤的形态和临床表现不同等生物学差别，可以利用基因表达芯片、比较基因组杂交、原位荧光杂交、Q-PCR和突变分析等来分析。通常许多因素可以破坏正常细胞的调控，其中包括：病毒感染、DNA甲基化和基因序列改变。当这些因素影响到调控细胞分化、修复、凋亡和血管再生的基因时，肿瘤就发生了。当前的分子学技术已成为研究肿瘤生物学和发现导致肿瘤的内在和外部因素的有效工具。

微阵列连同聚类分析可以破译和比较分析生物系统中全基因组表达模式。分层收集不同条件下基因表达的微阵列数据。

利用微阵列分析，研究者已经根据基因表达的不同对许多恶性肿瘤进行分类，例如：淋巴瘤、白血病、肺癌、遗传性及散发乳腺肿瘤。每一种肿瘤在其进展过程中都有一明显特征，显示其分子生物学历史。基于标本中的每一个细胞类型独特的表达特征，可以对肿瘤组织进行分子水平的解剖。例如：在乳腺肿瘤中，标本中的乳腺肿瘤细胞的特异基因表达能将其与其他细胞，如淋巴细胞和基质细胞区别开。另外，组织学分类中的分子亚型细胞也能区分。例如：慢性B细胞淋巴细胞白血病有两种类型，弥漫性大B淋巴细胞瘤有两种类型，非小细胞肺癌有五种类型（包括三中腺癌），侵入性导管细胞乳腺肿瘤至少有四种分子学类型。这些分子亚型很重要，因为可以利用它们来预测病人的结局和解释解剖诊断一样的肿瘤在自然转归中的变化。

还可以从肿瘤相关的突变得到各多的信息。基因表达谱有时可以反映特定基因的突变。

目前为止，在人类肿瘤中最普遍的突变是抑癌基因的突变如：p53。、50%以上的恶性肿瘤存在p53基因突变，在头、脖、肺、皮肤、膀胱和结肠癌中尤为常见。p53突变与肿瘤的侵袭生长的组织特征、早期浸润和耐药有关。在乳腺癌中p53的突变率为20%-30%。多变量分析表明p53突变是乳腺癌对他莫西分治疗反应差的一个独立的预测指标。核酸技术在检测p53状态上比免疫组织化学（IHC）法好。在许多肿瘤中，IHC检测的p53与突变的状态有关，但是一致性差。在外科病理学中IHC是一个检测分子标志物的简单方法，但是它易因抗体特异性的不同、评分的标准以及贮存因素而发生变化。另外，核酸技术还可分析治疗反应相关特异突变，为残余疾病提供分子标志物。

在病理学中对实体肿瘤标志物的需要是很明确的。但是怎样用好这些新的实验方法是不确定的。例如，为了保持组织结构的完整性，要将标本用福尔马林固定石蜡埋片。但是这样将会导致mRNA的回收不可靠。因此，用微阵列分析或者逆转录来进行表达分析是不可行的，除非我们改变实体肿瘤标本的保留方法。DNA和蛋白质标志物在结构上比RNA标志物稳定，可以在外科病理学中利用这些标志物来确认突变的状态和基因的表达。

定量分析

IHC是一种针对蛋白质表达的半定量技术，解剖病理学家可以用光学显微镜来分析。IHC很经济，而且检测标志物同时可进行组织学评价，但它是一种很容易出现错误的方法。这一点在计算乳腺癌中HER--2蛋白的过量表达中尤其明显。HER--2阳性表明有肿瘤恶化和预后差。曾提倡用以IHC为基础的检测HER--2蛋白的“HercepTest”用于预测对“Herceptin”的反应。但是它很难区别背景染色和弱阳性结果。

另外，不同的商品化抗体可以产生不同的结果。因HER—2 IHC有困难，所以大多数实验室用FISH法来代替它来检测HER--2基因的扩增。FDA批准了两中FISH方法用于检测HER—2。两种FISH法有很好的一致性，但是同IHC一致性很差。HER—2检测的这一经历突出了实体肿瘤分子分析中实验的相容性和可靠性的要求，随着更多标志物的出现和应用，这种需要将更迫切。

实时定量PCR

实时定量PCR技术的进展与微阵列技术同步。这种技术是均质方法，它包括扩增和分析，不需要铺凝胶，无放射性以及样本处理。现在有不少可用的商品化平台，即可以检测荧光的热循环仪。PCR过程中，检测每一个循环中DNA染料或探针的荧光强度。达到一定循环数，产物的聚集使其荧光强度超过了背景。这一点量化为第二衍生最大值（交叉点Cp），Cp同初始模板的拷贝相关。

初始模板拷贝数多，荧光出现早，Cp值低。可以根据Cp值的不同来判断两样本（实验和对照）的相对拷贝数。因为PCR是一个指数过程，相对拷贝数等于PCR效率的△Cp次方。由于难以得到不同样本中的DNA总数量，通常用假定不变参考基因对检测基因的结果标准化。对给定肿瘤基因组稳定区（如未变）可以用CGH来确认，用作DNA的质控。一种经济和常用的替代微阵列分析的方法就是实时PCR的相对定量法，它是利用SYBR Green I做双链DNA产物的荧光指示剂。

Cp值和初始拷贝数的关系和利用Cp值和初始拷贝数计算PCR扩增效率的方法见图2A，B。PCR扩增曲线利用血清中蛋白的特异探针产生。白细胞DNA基因组浓度10倍系列稀释物的。对每一个稀释度以每个循环的荧光强度和循环数为参数来作扩增曲线。以DNA基因组的对数和每一个稀释物的Cp值做回归直线来计算PCR反应的平均效率。这个效率可以用下面的公式计算。直线的y轴截距表示最低检测限。