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PCR技术

逆转录酶原位 PCR 实验

PCR
2024-05-16 PCR技术 加入收藏
原理原位 PCR 仪,盖玻片,培养箱,湿盒,RT-PCR 试剂盒,Permount材料与仪器组织样品和细胞培养物Nuclear Fast Red 甲醛缓冲液 检

原理

原位 PCR 仪,盖玻片,培养箱,湿盒,RT-PCR 试剂盒,Permount

材料与仪器

组织样品和细胞培养物
Nuclear Fast Red 甲醛缓冲液 检测溶液 DEPC 处理的水 PBS KH2P04 二甲苯 乙醇 牛血清白蛋白 SSC NBT BCIP 显色剂 胃蛋白酶 DNA 酶 Taq DNA 聚合酶 RNA 酶 inhibitor DNA 酶缓冲液 dUTP 抗地高辛的偶联物 PCR 引物
原位 PCR 仪 盖玻片 培养箱 湿盒 RT-PCR 试剂盒 Permount

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

Nuclear Fast Red

10%(体积分数)甲醛缓冲液 (Polyscientific)

检测溶液(0.1mol/LTris-HCl、pH9.5,0.1mol/LNaCl)

DEPC 处理的水

磷酸盐缓冲液(PBS)(137 mmol/LNaCl,2.7 mmolKCl,10 mmol/LNaHPO4)

2 mmol/LKH2P04,pH7.0, 用于细胞培养物

二甲苯(用于组织样品)...

乙醇

牛血清白蛋白(BSA),20 g/L

SSC,20X(3mol/LNaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠,pH7.0)

NBT/BCIP 显色剂 (EnzoClinicalLabs)

2. 酶和酶缓冲液

胃蛋白酶 (2 mg/ml)(Enzo Diagnostics)

配时加 20 mg 的胃蛋白酶,9.5 mlH2O 和 0.5 ml  2mol/L HCl

无 RNA 酶的 DNA 酶(Boehringer Mannheim)

Taq DNA 聚合酶 Gold(Applied Biosystems,FosterCity,CA)

RNA 酶 inhibitor(Applied Biosystems)

DNA 酶缓冲液,10X

配时加 35ul 的乙酸钠(3mol/L,pH3)、5ulMgS04(lmol/L) 和 60ulDEPC 处理的 H2O。

3. 核酸和寡核苷酸

地高辛标记的 dUTP(Boehringer Mannheim),1mmol/L

4. 抗体

抗地高辛的偶联物(antidigoxigen inconjugate)(Boehringer Mannheim)

合适的 PCR 引物

5. 专用器材

硅烷化的载破片(Ventana)

原位 PCR 仪(AppliedBiosystems)

聚丙烯薄片(polypropylenesheet),用来作盖玻片(有高压消毒的袋装市售)

设定为 37°C 和 60°C 的培养箱

湿盒(垫有浸透水的纸巾的有盖的盒子)

6. 其他

RT-PCR 试剂盒(AppliedBiosystems)

这一试剂盒包括 RT-PCR 需要的缓冲液、核苷酸、RNA 酶抑制剂、锰溶液、rTthDNA 聚合酶以及对照引物。

石蜡包埋以及切片所需要的试剂和器材(用于组织祥品)

Permount

7. 细胞和组织

合适的组织样品和细胞培养物

许多试剂包括蛋白酶、缓冲液、洗液、显色剂、探针和复染剂都包含在原位杂交的试剂盒中。现在许多生物公司出售该试剂盒。

二、方法

1. 组织切片和细胞样品的准备

(1)将材料放入 10% 的甲醛缓冲液中固定 8~15 h,然后用石蜡包埋。

(2)如果是细胞培养物,直接将 PBS 加入到培养平板中清洗一次细胞。再加入 10% 的甲醛溶液,固定过夜,然后用乳胶刮刷将细胞从平板上刮下来。将收集的细胞在 DEPC 处理的 H2O 中清洗两次,放入台式离心机中 2000r/min 离心 3 min。将细胞重悬于 5 mlDEPC 处理的 H20 中,取 50ul 滴加在载破片上(最佳浓度:2500~7500 个细胞),风干,室温保存。

(3)取至少 3 份 4um 厚的石蜡组织切片或 3 份细胞悬浮液至硅烷化的载坡片上,并使材料固定在载破片上。
硅烷化处理对细胞黏附是非常必要的。

(4)将组织切片在新鲜的二甲苯中放置 5 min 除去石蜡,然后将其放入 100% 的乙醇,5 min 后取出,风干。

2. 蛋白酶处理

(5)将制好的片子放入胃蛋白酶溶液中,37°C 温育适当时间。

确定蛋白酶孵宵的时间见表 19-1 和表 19-2. 除胃蛋白酶外,其他的蛋白酶也可用作消化处理。详细信息参见 19.2.1.2 蛋白酶消化。

(6)将玻片放入 DEPC 处理的 H20 中 lmin, 以使蛋白酶失活,然后将其放入 100% 的乙醇中 1min, 取出,干燥。

这样简单的清洗步骤就足以除去/灭活胃蛋白酶,不需要加热灭活。

3.DNA 酶处理(适用于逆转录酶原位 PCR)



(7)在 3 张片子的 2 张上加 lul10XDNA 酶缓冲液、lul 无 RNA 酶的 DNA 酶(10U/ul、8ulDEPC 处理的 H20。也可以选用 RT/PCR 的缓冲液代替 10XDNA 酶缓冲液。

(8)按照玻片上样品材料的大小将聚丙烯薄片(polypropylenesheet) 裁成合适的尺寸,盖在所加的溶液上以防止其变干。将破片放入湿盒内,37°C 温育。

(9)消化过夜后,移去盖片,将载坡片放入 DEPC 处理的 H20 中清洗 lmin, 然后放入100% 乙醇中,取出,干燥。

4. 反转录

(10)取一无菌的离心管,加入如下 RT/PCR 的试剂。

EZ 缓冲液(AppliedBiosystems)                                                                                 10ul

4 种核苷酸(dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP,每种核苷酸的浓度均为 10mmol/L)         各加 1.6ul

牛血清白蛋白(200 g/L)                                                                                              1.6ul

DEPC 处理的 H20                                                                                                        15.lul

MnCl2(或者乙酸锰)溶液(10 mmol/L)                                                                       12.4ul

正义引物(20umol/L)                                                                                                   2.0ul

反义引物(20umol/L)                                                                                                    2.0ul

RNA 酶抑制剂                                                                                                                0.5ul

地高辛标记的 dUTP(1mmol/L)                                                                                        0.6ul

rTth                                                                                                                                 2.0ul

(11)将配好的 RT/PCR 的反应溶液加在经过 DNA 酶处理的 2 张破片中的 1 张上。

(12)为了防止变干,用一小滴指甲油将聚丙烯盖片固定在载玻片上,将载玻片放入一个铝「船」(aluminum「boat」)内,并在其上覆盖无菌的矿物油。然后放在热循环仪的模块(block) 上,于 60°C 保温 30 min。
AppliedBiosystcms 公司的 Amplicover/Ampliclip 方法可用来替代矿物油。

5.PCR



(13)将一无菌的离心管置于冰上,加入如下 PCR 反应试剂。

Taq聚合酶缓冲液(AppliedBiosystems)                                                                            5ul

dNTP 溶液(每种核苷酸均为 10 mmol/L)                                                                         9.0ul

MgCl2,25 mmol/L                                                                                                              8.0ul

牛血清白蛋白,20 g/L                                                                                                      1.6ul

H2O                                                                                                                                 22.4ul

正义引物(20umol/L)                                                                                                       2.0ul

反义引物(20umol/L)                                                                                                       2.0ul

Taq 聚合酶 Gold(10U/ul)                                                                                                  2.0ul

(14)在每一个样品上都加上 PCR 反应混合物,进行如下热循环反应。



(15)从载玻片上除去盖片和指甲油。在二甲苯中洗 5 min 后放入 100% 的乙醇中 5 min,取出,风干。

6. 检测

(16)将玻片放入含 2 g/LBSA 的 0.2XSSC 中,60°C 洗 15 min(适用于逆转录酶原位PCR)。
对做原位杂交 PCR 而言,如果使用至少 80bp 大小的全长基因组探针,就用上述洗液清洗。如采使用小于 45bp 的寡探针杂交,则用含 20 g/LBSA 的 1XSSC 在 45°C 洗 10min。

(17)除去残余的洗液,每张载玻片加 100ul 含地高辛抗体(按 1:150 稀释)的 0.lmol/L Tris-HCl,pH7,5,0.1mol/LNaCl 溶液。37°C 温育 30 min。

(18)用检测溶液洗玻片 lmin,然后将其转入含有 NBT/BCIP 显色剂的检测溶液中,37°C溫育 5~30 min, 在经销商的使用说明中有详细说明(EnzoClinicalLabs)。如果是直接将标记物掺入到扩增 DNA 中,则温育时间可短些;如果是使用探针检测,则温育时间要求长一些。将载玻片放在显微镜下镜检,当见到强烈的信号时终止反应。对原位杂交 PCR 而言,探针-扩增子复合物应当杂交 15 h; 针对此目的推荐使用地高辛标记的探针。同时,在允许的情况下尽可能地使用最长的探针(最好 80~100bp), 这很重要。由于引物的低聚反应一般不会在原位杂交 PCR 中发生,因此可以使用包含引物区段的全长探针。同样,使用随机延伸的方法标记探针也很重要(Nuovo1997)。如果使用较短的探针,它们不得短于 45bp, 并且要采用 3'末端的方法标记(Nuovo1997)。

(19)将载玻片在水中清洗 1 min,用 nuclearfastred 复染 5 min,再在水中清洗 1 min,然后放入 100% 乙醇中 lmin,二甲苯中 lmin。用 Permount 封片,显微镜下观察。



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