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PCR技术

间接原位PCR(原位杂交PCR)

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
材料与仪器组织或细胞样品SSC 硫酸葡聚糖 甲酰胺 脱脂奶粉 Denhardt’s 液 SDS 变性的鲑鱼精DNA Rnase DTT 乙醇玻片 石蜡膜 橡皮泥

材料与仪器

组织或细胞样品
SSC 硫酸葡聚糖 甲酰胺 脱脂奶粉 Denhardt’s 液 SDS 变性的鲑鱼精DNA Rnase DTT 乙醇
玻片 石蜡膜 橡皮泥 湿盒

步骤

一、预杂交
 
1.   试剂与配制
 
2×SSC
 
50%去离子甲酰胺:用4×SSC配制(v/v)
 
预杂交液:2×SSC,5%硫酸葡聚糖,50%甲酰胺,0.2%脱脂奶粉
 
2.   操作方法
 
(1)在进行完原位PCR扩增后,用2×SSC预浸经乙醇脱水、空气干燥的玻片,并简洗15 min;
 
(2) 用50%去离子甲酰胺37℃孵育15 min;
 
(3)加预杂交液20 μl/片,在杂交温度下孵育30 min~2 h。
 
二、杂交
 
1.  试剂与配制
 
杂交液:50%去离子甲酰胺,5×SSC,10%硫酸葡聚糖,5×Denhardt’s 液,2%SDS,10 mg/ml变性的鲑鱼精DNA
 
2.  操作方法
 
(1)弃预杂交液,加杂交液(含0.2~5 μg/ml探针)10~20 μl/片,覆盖经硅化的盖玻片,石蜡膜封片或橡皮泥封片;
 
(2)玻片置于湿盒中,42℃杂交12~18 h(过夜,但不能超过24 h)。
 
三、杂交后处理
 
1.  试剂与配制
 
2×SSC
 
Rnase(20 μg/ml)
 
50%去离子甲酰胺
 
10 mmol/L DTT
 
2.   操作方法
 
1.   杂交完毕,用2×SSC浸泡玻片数分钟,轻轻移去盖玻片,再用2×SSC洗玻片1~2 min;
 
2.   2×SSC(含20μg/ml RNase,适宜RNA探针,DNA探针可省略此步)中洗片30 min,37℃;
 
3.   2×SSC/50%去离子甲酰胺,42℃×10 min;
 
4.  1×SSC/50%去离子甲酰胺,37℃×30 min,2次;
 
5.   4×SSC/10 mmol/L DTT洗1 h;
 
6.   0.1×SSC洗2次,每次37℃×30 min;
 
7.   PBS中洗10 min,即可进行显色,方法同上。

注意事项

1.  如果检测mRNA,双链探针应变性处理,方法是95~100℃加热10 min后迅速置于冰中骤冷;
 
2.   以单链探针检测DNA时,DNA也需变性处理,将玻片置于70~80℃变性液(70%去离子甲酰胺,即甲酰胺/2×SSC,v/v)中10 min;
 
3.   用双链探针检测DNA时,可按上述方法变性处理。


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