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PCR技术

胰岛素受体对胰岛素亲和性的测定实验

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
材料与仪器牛血淸白蛋白 猪胰岛素 [125I]胰岛素(受体级) 结合缓冲液步骤材料[125I]胰岛素(受体级)(DuPontNENNEX196)猪胰岛素(如,S

材料与仪器

牛血淸白蛋白 猪胰岛素 [125I]胰岛素(受体级) 结合缓冲液

步骤

材料

[125I]胰岛素(受体级)(DuPontNENNEX196)

猪胰岛素(如,Sigma Chemical Co,I3505)

牛血淸白蛋白(BSA;1%)

试剂

结合缓冲液(冷配体置换实验用)

(配方,见 试剂的配制  PP.234~240)

操作程序

1)于微量离心管中建立下列反应体系:



2)各离心管置摇床上,室温下孵育2h。

3)各管用微型离心机离心20min,去上清。

4)用γ;-计数器计数离心管内的放射性强度。分别从第1至6管的cpm值中减去第7管的cpm值(非特异性cpm值和本底cpm值),得特异结合的cpm值。

5)将各管的特异性结合cpm值除以总cpm值,得与膜结合的那部分胰岛素所占的份额。该值乘以各管中的胰岛素浓度,即得配体-受体复合物的浓度([HR],亦称[B],它表示结合的配体)。

6)从管中的胰岛素浓度减去[HR],得游离配体的浓度([H],亦称[F],它表示游离的配体)。

7)至此,可用几种方法分析所得的结果。如能用计算机程序,将数据直接代入下式则更好:



也可通过[HR]对log([H])作图来分析这些数据。此图应给出S型曲线。于是,可分别从[HR]的最大值和曲线的拐点得出受体总数和KD值(Klotz,1982)。第三种方法是用斯卡査德(Scatchard)图分析数据,斯卡査德图就是所作的图。若只有一种类型的结合位点,则斯卡査德图为一直线。为作斯卡査德图,先要确定对应于每个[H]的[HR]/[H]值,然后以[HR]/[H]值对[HR]作图,此线的斜率为-1/KD,横坐标的截距力受体总数([R]t)。若有多于一种类型的结合位点,且有不同的亲和性时,斯卡査德图将是一条曲线而不是直线。


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