Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > PCR技术

PCR技术

核糖克隆实验

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
材料与仪器ATEN 缓冲液 DNA 缓冲液(TEN) KLA 缓冲液 T5E5 Dpn I Klentaq LA 蛋白酶 K 蛋白酶K储存缓冲液 RNA 酶 A

材料与仪器

ATEN 缓冲液 DNA 缓冲液(TEN) KLA 缓冲液 T5E5 Dpn I Klentaq LA 蛋白酶 K 蛋白酶K储存缓冲液 RNA 酶 A 设计好的载体 已经进行 5'端生物素-TEG 修饰 并且 3'端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修饰过的引物 卡那霉素(Sigma) 四环素 Ticarcillin
电转化仪器 PCR(薄壁)试管 管壁厚度规则的试管 链霉抗生物素蛋白珠子

步骤

—、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂.

10XATEN 缓冲液

0.5mol/LTris-HCl,pH7.9

2.5mol/L 氯化钠

0.25mol/L Na4EDTA,pH7.9

甜菜碱(SigmaB-2629)

蓝色葡聚糖(bluedextran)(SigmaD-5751)

DNA 缓冲液(TEN)

10mmoI/LTris-HCl,pH7.9

10mmol/L 氯化纳

0.1mmol/L EDTA

乙醇, 用 25% 的 DNA 缓冲液配成 75%

10X KLA 缓冲液

500 mmol/L Tris-HCl 碱 (Sigma;TrizmaBase)

160 mmol/L 硫酸铵

1%Tween20

25 mmol/L 氯化铁

未调整前 pH 为 9.2, 逐滴加入盐酸调整 pH 到 7.9,单独取出液滴来检测 pH, 以防 pH 计探针上的DNA 污染缓冲液。

30% 聚乙烯乙二醇 3350(PEG),1.5mol/L 氯化钠

乙酸钠,3mol/L,pH5.6

T5E5

5 mmol/L Tris-HCl,pH7.9

5 mmol/L Na4EDTA,pH7.9

2. 酶和酶缓冲液

Dpn I

Klentaq LA(Barnes1994;Clontech8421-1)

蛋白酶 K(Roche1373196)

蛋白酶 K 储存缓冲液

100umol/L β-巯基乙醇

20 mmol/L Tris-HCl,pH7.9

1mmol/LCaCl2

50%(体积分数)甘油(630 g/L)

RNA 酶 A(Ambion2270 或 2272)

3. 核酸和寡核苷酸

设计好的载体

已经进行 5'端生物素-TEG 修饰,并且 3'端核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶修饰过的引物

4. 抗生素

卡那霉素(Sigma), 终浓度为 25ug/ml

四环素 (Calbiochem),终浓度为 12ug/ml

Ticarcillin(SmithKline Beecham),终浓度为100ug/ml

5. 专用设备

电转化仪器

PCR(薄壁)试管;管壁厚度规则的试管;0.5 ml 或 1.7 ml

链霉抗生物素蛋白珠子

6. 细胞和组织

电击感受态细胞(Dower et al.1988;Invitrogen 18290-015)

二、方法

1. 应用末端为核糖胞嘧啶或者核糖尿嘧啶的引物和 KLA 缓冲液(PH7.9) 分别在1.3mol/L 和 1.9mol/L 的甜菜碱中扩增目标片段和载体序列。一些载体的质粒复制子在 pH9.2 条件下标准的长 PCR 反应中扩增得更好,但是 colEl 复制子在 pH7.9 条件下扩增得好。

为了得到最佳的扩增效率,应该使用已经进行 5'端生物素-TEG 修饰过的引物和如下所述的链霉抗生物素蛋白珠子,与其他 DNA 聚合酶相比,Klemaq LA 酶混合物(BameS1994) 得率更高,而且它对甜菜碱的抗性更强(Baskaran et al.1996)。

以质粒做模板的 PCR 效率稍高,并且如果在 PCR 之前用限制酶将模板线性化,模板转化进大肠杆菌细胞造成的最终背景要低些。

如果用来扩增栽体或目标片段的模板来自 dam+大肠杆菌,Dpn I 选择通常是个好的办法,并且可能会导致后续克隆步骤中出现不必要的背景。Dpn I 不能酶切 PCR 产物,因为含有非甲基化的 GATC 位点 (Weiner et al.1994)。

2. 向每个100ul 的 PCR 反应中,加入 1ul(10U)Dpn I,37°C 温浴 2 h。

这种处理可以把单纯载体或单纯目标片段的背景降到 0~20 个菌落。

3.PEG 沉淀步骤。这步的目的是要除去引物和盐。把 PCR 反应移到厚壁(管壁厚度均匀)试管,0.5 ml 或 1.7 ml 都可以,因为薄壁 PCR 试管不能用来离心。然后,加入 5ul lmg/ml 蓝色葡聚糖(用它来显示沉淀的位置)和 1/2 体积 30%PEG3350、1.5mol/L 氯化钠(最终为 10%PEG,0.5mol/L 氯化钠)。室温放置 30 min 或 4°C 过夜。离心 15 min。看着蓝色沉淀倒去上清液,以免不小心倒掉沉淀。如果沉淀很薄看不见,尽董避免倒掉沉淀,但是同时保留上清液。用 75% 乙醇淋洗沉淀,离心 8 min。在空气中干燥沉淀 10~20 min。用 100ul 的 T5E5 缓冲液重悬沉淀,置于冰上至少 lOmin, 并不时振荡。

4. 胰腺 RNA 酶 A 步骤。用 T5E5 缓冲液稀释 200ugRNA 酶 A 到 200ug/ml。也可以使用 DNA 缓冲液(E.Oates,个人交流)。向每 100ul 的 PCR 产物中加入 6ug(30ul)RNA 酶,振荡并轻轻离心。然后把含有 RNA 酶的 PCR 产物放在 55°C 温浴 30 min,冷却。

5. 蛋白酶 K 步骤。应该用蛋白酶 K 保存缓冲液将酶在-20°C 保存(见材料单)。加入 5ug 蛋白酶 K 或大约相同质量(6ug) 的上述 RNA 酶,充分混合,稍微离心一下,65°C 温浴 30 min,冷却。
如果使用生物素引物,立即逬行下述的珠子纯化步骤。否則 DNA 就已经准备好了。

6. 克隆步骤。取 2~8ul 的载体或目标片段样品进行琼脂糖凝胶电泳,并在旁边加一个浓度标准,用来同时确定载体 DNA 和目标片段的浓度。克隆时它们的物质的量应该相等,浓度是否精确并不重要。

1~10ul 载体=30~100ng,0.02pmol

1~10ul 目标片段=5~25ng(目标片段和载体物质的量相等)

加入 1XATEN 缓冲液至 40ul

7. 各取 20ul 克隆混合物作不同的对照,比如在加热前、没有加热、凝胶样品等的对照。按比例配制更多所需的克隆混合物。最小用 40ul:20ul 做凝胶电泳,20ul 用来转化细胞。





8. 珠子纯化的 DNA 可不需要退火,因为它似乎在室温下可以进行自组装(数据没有给出),但是这个加热步骤对非生物素引物非常有帮助。
78°C 溫浴 2 min, 然后 52°C 溫浴 30 min; 或者,先 78°C 溫浴 2 min,再 65°C 溫浴 lOmin, 然后在大于 30 min 的时间内慢慢地把温度降到 52°C 或者更低,冷却。保存 20ul 用作退火后凝胶检测样品。
这些凝胶样品可以用来检测和提高重组效率。常规克隆时可以跳过这步不做,但是,就像做任何 DNA 克隆实验一样,如果出错了,实验者不做凝胶分析就不知道是什么发生了错误.

9. 加入 1/9 或者 1/6 体积的 3mol/L 乙酸钠(pH5.6) 和 2 mg 蓝色葡聚糖,加入 2~3 倍体积的乙酵沉淀 DNA, 在-20°C 冷藏至少 30 min, 然后离心 10~15 min。用 75% 乙醇:25%DNA 缓冲液淋洗可见的沉淀,然后离心 8 min。在这步 75% 乙醇淋洗中,在 DNA 缓冲液中加入了少量的盐,这样 25bp 的黏性末端就不会在下面的步骤中解链。

10. 在冰上用 22ul 的水重悬干燥的沉淀,加入的水会由于蓝色葡聚糖变成轻微的蓝色。
取出用作电泳样品或者作为转化的备份。

11. 用 15ul 的 DNA 去电击转化 70ul 的电击菌感受态,在 5s 中之内加入 1ml 的丰富培养基,然后将其涂在恰当的抗生素培养基上:10min 后涂在 100ug/ml 替卡西林板上,或者 30°C 5~16 h 后涂在 25ug/ml 的卡那霉素板上,或者在 30°C 2 h 后涂在 12ug/ml 的四环素平板上。延长电转化后的培养时间对于表达一些抗生素基因的抗性是必需的。


文章底部广告位

文章评论

加载中~