PCR技术

菌落 PCR 分析克隆的重组体实验

2024-05-15 PCR技术加入收藏

原理菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。使用载体上的通用引物

原理

菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增，省时少力。使用载体上的通用引物，进行重组体的筛选或者DNA测序分析。最后的PCR产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。

材料与仪器

菌落
溴化乙锭 Taq 延伸 PCR 添加剂 Tween20 10% 溶液dNTP 溶液 PCR 缓冲液热稳定 DNA 聚合酶引物
无菌枪头琼脂糖凝胶电泳设备和试剂

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

溴化乙锭

Taq 延伸 PCR 添加剂（Stratagene)

Tween20，10% 溶液

2. 酶和酶缓冲液

dNTP 溶液（包含所有的 4 种 dNTP，每种都是 25 mmol/L)

PCR 缓冲液，10X, 用户买热稳定聚合酶时公司一并提供，或者 PCR 优化缓冲液，比如，Opti-Prime PCR 优化试剂盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen)

热稳定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)

3. 核酸和寡核苷酸

可选择：插入物特异的引物（在双向克隆中用来确定插入物的方向）

一套筛选重组体的引物

4. 专用设备

用于划板和接菌的无菌枪头

用枪头代替牙签，是因为牙签可通过毛细作用带走液体，因此会改变反应混合物的浓度。

5. 額外项目

琼脂糖凝胶电泳设备和试剂，包括溴化乙锭

二、方法

1. 根据反应数目或要做的 PCR 反应的管数，在冰上用一个离心管像调鸡尾酒一样准备

PCR「鸡尾酒」式混合物，按如下顺序依次加入各种成分。

H2O 将终体积补充到 25ul

Taq 缓冲液，10X                                              2.5ul

Tween20(体积分数 10% 溶液）                               1.0ul

dNTP 混合物（每种 dNTP 为 25 mmol/L)                     0.2ul

重组体筛选引物套（100ng/ul)                                     1ul

Taq 延伸 PCR 添加剂（5U/ul)                                     0.25ul

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)                                              0.25ul

2. 在冰上，分装"鸡尾酒"式 PCR 混合物到每一个 PCR 试管中，每管移取 25ul。

3. 对照反应中，加入 1ul 的非重组 DNA。
可以选择：对于用来确定插入方向的反应，向恰当的反应管中加入第三个插入物特异的引物。

4. 对于重组筛选，用一个无菌枪头刺挑一下转化后长出的菌落，然后在相应的反应管中搅动菌落物质。在给每一个反应混合物接种后，迅速地移走枪头，并在含有抗生素平板上轻涂以留菌种，以备后续分析。对于 PCR 介导的重组筛选，也可参考下面的疑难解答。

5. 轻轻混匀每个反应体系。

6. 用推荐的循环参数进行 PCR。

7. 用标准的琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。推荐用 10~15 g/L 琼脂糖凝胶来优化分辨500~6000bp 的 PCR 产物。通常，取 1~5ul PCR 产物经溴化乙锭染色后分析。可以通过传统的瞬间成像技术或计算机图像软件来获取图像。

注意事项

1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳，同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

2. 使用的引物浓度不能太高，浓度过高会导致非特异性扩增，反应的循环数也不能太多，一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题，有的GC含量很低，有的又很高，导致菌落PCR不容易扩增出目的条带，在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限，每一循环降0.2度左右。

常见问题

牙签可通过毛细作用带走液体，因此会改变反应混合物的浓度。