免疫PCR技术

（一）材料与方法

1. 生物素标记特异性抗体的制备

免疫球蛋白（如IgG、IgM）的Fc片段上有糖基存在，因而可用能与糖基结合的Biotin-hydrazide作生物素标记。

（1） 将纯化的抗体（IgM或IgG， 0.1~1.0ml）在标记缓冲液（0.1Mol/L NaAc，pH值5.5， 0.1Mol/L NaCl）中4℃透析过夜。

（2）吸取0.5ml至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度为10mMol/L，置冰浴上于暗处孵育30min，使抗体分子上的糖基氧化。

（3）将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD-10预装柱，使之与过碘酸钠分开。收集蛋白峰。

（4）向抗体管中加入Biotin-LC-hydrazide(Pierce)至终浓度5mMol/L，置混摇器上室温孵育1h。

（5）用含0.02%NaN3的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游离的生物素分开。收集蛋白峰，保存-20℃。

2. 生物素标记DNA片段的制备

作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标本。

DNA片段大小为300~500bp，生物素标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成一对引物，其中一个引物的5’端碱基上带有生物素标记。在0.5mlPCR管中按表将下列试剂混合。

95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min;55℃ 1min; 72℃ 1min; 40个循环。最后72℃延伸10min。加等量酚-氯仿抽提，然后加10ul 3Mol/L Kac，250uL无水乙醇，置-70℃ 30min。离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。 将沉淀DNA干燥后溶于TE缓冲液中，保存在-20℃。

3. 制备抗体-亲和素-DNA复合物

将生物素标记的抗体与亲和素按等分子浓度混合于含有1mg/mlBSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的生物素标记的DNA片段，继续孵育30min，最后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位饱和。

最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加入BSA达1mg/ml，分装后冻存于-20℃。

4. 免疫PCR

（1） 按常规ELISA方法，用饱和缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或0.5mlPCR管中，4℃过夜。

（2） 用PBS洗三次，然后每孔加200ul封闭液（PBS含10mg/mlBSA，1mg/ml鱼精DNA），室温孵育30min。 （3） 用TETBS（其配方：20mMol/L EDTA，0.02%NaN3）洗三次。

（4） 将抗体-亲和素-DNA复合物稀释于含有1mg/mlBSA和0.1mg/ml鱼精DNA的TETBS中，每孔加50ul，室温孵育1h。

（5） 用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。

（6） 每管中加50ulPCR反应液，含有表成分：