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PCR技术

制备克隆实验

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
材料与仪器ATP -巯基乙醇 IPTG X-gal 平末端限制酶 连接缓冲液 T4DNA 连接酶 平末端插入物 克隆载体 培养基FALCON 2059 多聚丙烯

材料与仪器

ATP -巯基乙醇 IPTG X-gal 平末端限制酶 连接缓冲液 T4DNA 连接酶 平末端插入物 克隆载体 培养基
FALCON 2059 多聚丙烯试管 37°C 恒温箱 水浴箱

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

ATP(10 mmol/L)

β-巯基乙醇(可选择)

IPTG(100 mmol/L,溶于水中)

X-gal(100 mg/ml,溶于二甲基甲酰胺)

2. 酶和酶缓冲液

平末端限制酶(5U), 比如,SrfⅠ限制性内切酶(Stratagene)

连接缓冲液,l0X(250 mmol/LTris-HCl、pH7.5,100 mmol/L 氯化镁,100mmol/LDTT,200ug/ml BSA)

T4DNA 连接酶(4U)

3. 核酸和寡核苷酸

平末端插入物(100ng/ul)

克隆载体(10ng/ul)

4. 培养基

(1)SOC 培养基(每升用量:20 g tryptone,5 g 酵母提取物,0.5 gNaCl,加水到 900 ml。高压灭菌。另外,单独混合好下面物质:2.03 g 氯化镁,1.2 g 硫酸镁,3.6 g 葡萄糖,加水到终体积为 100 ml,过滤灭菌。然后加入已凉下来的高压灭菌过的培基)。

(2)LB(Luria Broth) 球脂平板 [每升用量:lOg NaCl,lOg Bacto-tryptone,5 gBacto-酵母提取物,20 g Bacto 琼脂。用 5mol/LNaOH 调整 pH 到 7.0。加入去离子水到终体积为 1L。高压灭菌,然后倒入培养皿中(大约 25 ml/100 mm 平板)]。

(3) 青霉素-新青霉素 LB 平板(20ug/ml 青霉素,80ug/ml 新青霉素)。用来降低卫星菌落的形成。高压灭菌的培养基冷却到 55°C, 再加入过滤灭菌的抗生素。

(4) 氯霉素 LB 平板(30ug/ml)。
高压灭菌的培养基冷却到 55°C, 再加入过滤灭菌的抗生素。

(5) 可以选做 X-gal/IPTG 平板:若要表型选择转化子,向含有适当抗生素的琼脂平板中加入 20ul X-gal 和 20ul IPTG 溶液,立即摇匀,使它们分布均匀(可能会出现轻微的沉淀)。
不要混合 X-gal 和 IPTG, 因为这些化合物会沉淀。
重要:在涂板前让平板干燥 15~30 min。

5. 专用设备

FALCON 2059 多聚丙烯试管

37°C 恒温箱

水浴,预设到 37°C、42°C、65°C

6. 细胞和组织

适当的大肠埃希菌菌株,比如,XLl-Blue(Stratagene),按照 Sambrook 和 Russe Ⅱ(2001) 所述方法做成感受态,或者去买做好的。

二、方法

1. 连接

(1)在一个高压灭菌的 1.5 ml 试管中建立 PCR-script 反应体系,按顺序加入如下试剂。

克隆载体(10ng/ul)                                 1ul

连接反应缓冲液,10X                              1ul

ATP(10 mmol/L)                                        0.5ul

Pfu 拋光 PCR 产物插入物                       1~4ul

Srf I 限制性内切酶(5U)                           1ul

T4DNA 连接酶(4U)                                 1ul

H2O                                                          补充到 10ul

~undefined对于连接反应,理想的插入物:载体 DNA 值是可变的。对于样品 DNA, 从 5:1(当用抛光插入物时)到 100:1(当用非拋光插入物时)可能是必需的。用非拋光插入物时需要更大的插入物:载体值,这是因为 PCR 片段两端都是平末端的机遇很低。对一个特定的插入片段,最好用下面的方程来优化条件:

                                                             pmol 末端/ugDNA=2X106/碱基对数目

(2)轻轻混匀,在室温温浴 1~2 h。

(3)65°C 热处理样品 10min。

(4)把样品在冰上保存,准备转化感受态大肠杆菌。

2. 转化

(1)在冰上融化感受态细胞。

(2)轻轻搅动混匀细胞,移取 40ul 细胞到一个 15 ml 预冷的 FALCON 2059 试管。

(3)可选做:向 40ul 细菌中加入,疏基乙醇(至终浓度为 25 mmol/L)。

(4)轻轻搅动,置于冰上 10min, 每隔 2 min 轻轻搅动一下。

(5)加入 2ul 已经热处理过的连接反应产物 DNA(第 4 步,克隆程序)。

(6)置于冰上 30 min。

(7)在 42C 水浴中热击 30s。要获得最高的效率,热击时间长短非常关键。

(8)把转化混合物置于冰上 2 min。

(9)加入 450ul 预热(42°C) 的 SOC 培养基,37°C225~250r/min 振荡培养 1h。

(10)取出 50~200ul(100ul 是标准用量)转化好的混合物,用一个无菌的到叉将它们均匀涂布于恰当的抗生素平板上。

可以选做:向 LB 平板中加入一种可以生成色素的底物来检测重组体;同时参见β-半乳糖苷酶颜色选择,如下。
如果涂 100ul 振荡培养物,可以直接把细胞涂布在平板上; 如果涂少于 100ul 转化混合物,用 SOC 培养基将转化混合物的最终体积增加到 200ul, 再进行涂板。

(11)将平板在 37°C 培养过夜(大约 16 h)。

(12)选择白斑进行检测,不要选那些有轻微蓝色或者中心是蓝色的克隆。
           含有插入的菌落最初是白色,在平皿中 2~5 天后可能会出现轻微的蓝色。


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