用经典 RACE 扩增 cDNA 的5’末端实验

GSP-RT 引物 poly(A)+RNA 或总 RNA 反转录缓冲液 RNA 酶 H RNasin SuperScriptII 逆转录酶 dNTP 溶液 DTT TE CoCl2 dATP 溶液 脱氧核苷酸末端转移酶 加尾缓冲液 HerculesHot-Start 聚合酶 HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液 5'末端加尾的 cDNA 库 寡核苷酸引物
热循环仪 水浴或加热仪 Microcon-100 过滤器

第 1 阶段：反转录产生 cDNA 模板

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

dNTP 溶液（含 4 种 dNTP，各 10mmol/L)

DTT(0.lmt)l/L)

TE(10mmol/LTris-HCl、pH7.5,1 mmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和缓冲液

反转录缓冲液，5X(制造商提供）

RNA 酶 H

RNasin

SuperScriptII 逆转录酶（Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

GSP-RT 引物（100ng/ul)

poly(A)+RNA 或总 RNA

4. 特殊设备

预设为 37°C、42°C、50°C、70°C、80°C 的水浴或加热仪

二、方法

1. 在一个无菌的离心管中，于冰浴上混合以下转录成分。

反转录缓冲液，5X                                             4ul

dNTP 溶液（含 4 种 dNTP, 各 10 mmol/L)         1ul

DTT(0.lmol/L)                                                     2ul

RNasin(40U/ul)                                                   0.25ul

2. 在另一个管中，混合 0.5ul 的 GSP-RT 引物（100ng/ul) 和 lug poly(A)+RNA 或5ug 总 RNA，再加 13ulH20。80°C 温育 3 min, 迅速在冰上冷却，在离心机中离心 5s。

3. 将 RNA/引物混合物加入到反转录成分中，然后加 1ul(200U) 的 SuperscriptII 逆转录酶，温和混匀，42°C 保温 1h，然后 50°C 保温 10min。

4.70°C 溫育 15 min，使逆转录酶失活，然后离心 5s。

5. 加入 0.75ul(1.5U) 的 RNA 酶 H 到管中，37°C 温育 20 min, 以破坏 RNA 模板。

6. 用 TE 将反应混合物稀释至 40ul，4°C 保存（这就是 5'末端无尾 cDNA 文库）。



第 2 阶段：在第一链 cDNA 产物末端加 poly(A) 尾
一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

CoCl2(25 mmol/L)

dATP 溶液（1mmol/L)

TE(10 mmolTris-HCl、pH7.5，1mmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和酶缓冲液

脱氧核苷酸末端转移酶（Tdt)

加尾缓冲液，5X(125 mmol/LTris-HCl、pH6.6，lmol/L 二甲胂酸钾，1250ug/ml BSA)

3. 特殊设备

Microcon-100 过滤器（Millipore) 或起相同作用的其他产品

预设为 37°C、65°C 的水浴或加热仪

二、方法

1. 用 Microcon-100 过滤器（Millipore) 或起相同作用的其他产品，去除 5'末端无尾cDNA 文库（由上面第 1 阶段第 2 步得到）中的过量引物，按说明进行操作，并用 TE 洗两次以上，总体积不要超过 15ul，用水将总体积调整至 15ul。

2. 加 4ul 的 5X 加尾缓冲液和 10U 的 Tdt。

3.37°C 保温 5 min, 然后 65°C 温育 5 min。

4. 用 TE 将体积稀释至 500ul, 保存于 4°C(这就是 5'末端加尾 cDNA 文库）。



第 3 阶段：扩增
一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

dNTP 溶液（含 4 种 dNTP，各 10 mmol/L)

TE(10 mmol/LTris-HCl、pH7.5,1mmol/LEDTA、pH8.0)

2. 酶和酶缓冲液

HerculesHot-Start 聚合酶（Stratagene)

HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液（10X)

3. 核酸和寡核苷酸

5'末端加尾的 cDNA 库（由上面第 2 阶段得到）

寡核苷酸引物 Qo、QT 和 GSPl(Q0 和 QT 的序列见图 25-2)

4. 特殊设备

可设程序的热循环仪

二、方法

1. 第一轮

(1) 在一个无菌的 0.2 ml 离心管中混合以下成分。

HerculesHot-Start 聚合酶缓冲液（10X)      5ul

dNTP 溶液（10 mmol/L)                            1.0ul

Hercules Hot-Start 聚合酶                         2.5U

H20                                                            至 50ul

(2) 加 1ul 的 5'末端加尾 cDNA 文库（来自第 2 阶段第 4 步）和 GSP1,Q0[见图 25-2(b)] 和 QT 引物各 25pmol。

(3) 混匀并在 DNA 热循环仪上 98°C 加热 5 min, 使第一链产物变性，并激活聚合酶。冷却至 48°C 退火 2 min, 然后 72°C 延伸 40 min。

(4) 按下列程序进行 30 个扩增循环。



2. 第二轮

(5) 取出部分第一链扩增产物，用 TE 以 1:20 稀释。

(6) 用上面的程序，但省略掉 2 min 的退火和 72°C40 mm 的延伸步骤，用 Q1 引物和 GSP2 引物扩增 1ul 上述稀释材料。