Northern 印迹分析实验
材料与仪器琼脂糖凝胶 菌落裂解缓冲液 蒸馏水 甲醛 甲酰胺预杂交 杂交液 HotPrime cDNA Labeling Kit 矿物油 MOPS 缓冲液 MOP
材料与仪器
琼脂糖凝胶 菌落裂解缓冲液 蒸馏水 甲醛 甲酰胺预杂交 杂交液 HotPrime cDNA Labeling Kit 矿物油 MOPS 缓冲液 MOPS 乙酸钠 EDTA PCR 缓冲液 SSC NaCl SDS NaCl NaH2PO4 [a-32P]dATP Lgh Rgh 引物 鲑鱼精 DNA Taq DNA 聚合酶
离心机 滤纸片 增光屏 离心管 硝酸纤维素膜或尼龙膜 移液器 闪烁计数器 Sephadex G50 柱子 单一感光科学成像胶卷 热循环仪 薄壁 PCR 管 塑料保鲜膜
离心机 滤纸片 增光屏 离心管 硝酸纤维素膜或尼龙膜 移液器 闪烁计数器 Sephadex G50 柱子 单一感光科学成像胶卷 热循环仪 薄壁 PCR 管 塑料保鲜膜
步骤
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭
菌落裂解缓冲液（PCR-TRAP Cloning System,GenHunter P404 或 L102)
Denhardt 溶液（500 ml)
Ficoll 5 g
聚乙烯吡咯烷酮（PVP) 5 g
BSA(PentaxFractionV) 5 g
蒸馏水 加至 500 ml
蒸馏水
12.3mol/L(37%) 甲醛，pH〉4.0
甲酰胺预杂交/杂交液（GenHimterMLl)，如果自己配制，使用下面的方案（500 ml)
20XSSPE 125 ml
50XDenhardt 溶液 50 ml
20%SDS 2.5 ml
甲酰胺 250 ml
蒸馈水 加至 500 ml
混匀后分装成较小体积，-20°C 保存备用。
HotPrime cDNA Labeling Kit(GenHunterH50)，包括 KlenowDNA 聚合酶（1U/ul)、10X 标记缓冲液、dNTP(—dATP) 或 dNTP(-dCTP)(500umol/L)、中止缓冲液以及蒸馏水
矿物油（可选）
10XMOPS 缓冲液
0.2mol/LMOPS
0.05mol/L 乙酸钠
0.01mol/LEDTA
10XPCR 缓冲液（RNAspectra Differential Display System，F501-F510&R501-R510,PCR-TRAP Cloning System，GenHunter，P404 或 S201)
20XSSC
3mol/LNaCl
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2 H20
用 1mol/LHC1 调 pH 至 7.0
1XSSC,1g/L SDS
0.25XSSC,1g/L SDS
20XSSPE
3mol/LNaCl
0.1mol/LNaH2PO4(二代盐）
0.02mol/LEDTA
中止缓冲液（0.lmol/LEDTA,pH8.0)
2. 核酸和寡核苷酸
[a-32P]dATP(3000Ci/umol/L)(1Ci=3.7X1010Bq)
dNTP(250umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHunter P404 或 S501)
Lgh/Rgh 引物（2umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHimter P404 或 L201&L202)
鲑鱼精 DNA(GenHunter ML2)
3. 酶和酶缓冲液
Taq DNA 聚合酶（Qiagen201207)
4. 专用设备
离心机
3 mm 滤纸片
增光屏
1.5 ml 离心管
硝酸纤维素膜或尼龙膜
移液器
闪烁计数器
Sephadex G50 柱子（Roche Applied Science 1814419，Indianapolis，IN)
单一感光科学成像胶卷 [推荐 Kodak Biomax MS，No.8715187(Kodak-Eastman，Rochester，NY)]
热循环仪
0.2 ml 薄壁 PCR 管
可透过紫外线的塑料保鲜膜 [推荐 Glad Cling Wrap(The Glad Products Company，Oakland,CA)]
5. 附加试剂
QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit(Qiagen20021)
二、方法
1.cDNA 探针的产生
（1）在每个克隆平板的底部，为每个待分析的四环素抗性菌落编号（推荐每个平板至少选 5 个）。
（2）在 1.5 ml 离心管中，各分装 5ul 菌落裂解缓冲液。
（3）用干净的移液头挑取每个菌落，尽量不要取太多（通常肉眼可见的很小量就足够了）。将细胞转到相应标记的 1.5 ml 离心管中。
（4）将离心管在沸水浴中温育 10min。
（5）以最大速度在室温下离心 2 min，以沉淀细胞残余物。将上清液转到干净的 1.5 ml 离心管中，弃去残余沉淀。
（6）裂解产物立即用于 PCR 分析，或保存在-20°C 备用。
（7）将下列组分加到 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，用来做菌落 PCR(强烈推荐先配制一个核心混合液，含有除了菌落裂解液以外的所有组分，这样可以将吸取样品的误差降至最小）。
蒸馏水 10.2ul
10XPCR 缓冲液 2.0ul
dNTP 混合液（250umol/L) 1.6ul
Lgh 引物 2.0ul
Rgh 引物 2.0ul
菌落裂解液 2.0ul
Taq DNA 聚合酶 0.2ul
混合均匀，如果需要加入 30ul 矿物油。
（8）按照下列程序设置热循环仪：94°C 30s → 52°C 40s → 72°C lmin → 30 个循环 → 72°C 5 min(延伸) → 4°C 保温。
（9）在含有溴化乙锭染料的 1.5% 琼脂糖凝胶上，将 20ulPCR 产物全部跑电泳。这不仅可以产生 Northern 印迹分析所用的 cDNA 探针，而且还显示出使用 PCR-TRAP CloningSystem 产生的 cDNA 克隆（见方案 6) 中哪一个含有正确的插入片段。
（10）用 QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit 从琼脂糖凝胶中纯化各条带。纯化片段做模板，用 HotPrime DNA Labeling Kit 产生探针。
（11）如果使用不同的载体进行克隆，要根据厂商的建议产生 Northern 印迹杂交所需的 cDNA 探针。
2.cDNA 探针的标记
（12）如果使用推荐的 HotPrime DNA Labeling Kit，将所有组分完全解冻后，立即置于冰上。
（13）在带有固定帽（这样在煮沸过程中管帽不会松动）的 1.5 ml 离心管中，配制下面的反应体系。
蒸馏水 11ul
10X 标记缓冲液 3ul
用于标记的 DNA 模板（10~50ng) 7ul
（14）将反应混合液在沸水浴中温育10 min。
（15）将反应管在冰上迅速冷却。短暂离心，收集冷凝水。
（16）按照下面的顺序加入反应试剂。
dNTP(-dATP)(500umol/L~undefined 3ul
[a-32P]dATP(3000Ci/mmol/L~undefined 5ul
Klenow DNA 聚合酶 1ul
~undefined如果用 [a-32P]dCTP 代替 [a-32P]dATP, 则用 dNTP(—dCTP) 代替 dNTP(-dATP)。
（17）将混合液在室温放置 20 min, 然后在 37°C 温育 10min。
（18）加入中止缓冲液，混匀。
（19）用 Sephadex G50 柱纯化标记的探针。用带有固定帽的 1.5 ml 离心管收集纯化的探针。在闪烁计数器中，对 1ul 标记的探针进行计数。对大多数标记的 DNA 探针，一共可以获得 1000 万或更多的 cpm。
3. 探针杂交
（20）制备变性琼脂糖（RNA) 凝胶（包括加样与电泳条件，以及 RNA 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜）的方案，在 Ausubel 等（1995) 及 Sambrook 和 Russell(2001) 中都有介绍。
（21）如果预杂交缓冲液保存在-20°C，则在 37°C 解冻 20 min。
（22）在沸水浴中温育 10 min, 变性鲑鱼精 DNA。
（23）在预杂交溶液中加入鲑鱼精 DNA(终浓度为 100~200ug/ml)，混匀。
（24）用 5 ml 或足够董的预杂交溶液将膜覆盖，在 42°C 下预杂交至少 4 h。
（25）用一个带有固定帽的 1.5 ml 离心管（否则管帽会松动），在水浴中煮沸10min, 以变性纯化的探针。
（26）在冰上冷却 2 min。
（27）离心甩下冷凝水，将探针直接加到预杂交溶液中。
（28）杂交过夜。
（29）小心地倒出放射性的杂交液，在专门盛放放射性废液的容器中处理。
（30）在室温下，用含有1g/LSDS 的 1XSSC 洗涤 2 次。都要在专用的容器中处理洗涤溶液。
（31）用预热的含有1g/L SDS 的 0.25XSSC，在 50~55°C 下漂洗 15~20 min。
4. 印迹曝光
（32）用 3 mm 的滤纸将膜吸干，并用可透过 UV 的塑料薄膜包起来。
（33）将印迹在带有强化屏的单色光胶片下曝光，在-70°C 具有最佳的检测信号。
1. 缓冲液、溶液和试剂
1.5% 琼脂糖凝胶，加溴化乙锭
菌落裂解缓冲液（PCR-TRAP Cloning System,GenHunter P404 或 L102)
Denhardt 溶液（500 ml)
Ficoll 5 g
聚乙烯吡咯烷酮（PVP) 5 g
BSA(PentaxFractionV) 5 g
蒸馏水 加至 500 ml
蒸馏水
12.3mol/L(37%) 甲醛，pH〉4.0
甲酰胺预杂交/杂交液（GenHimterMLl)，如果自己配制，使用下面的方案（500 ml)
20XSSPE 125 ml
50XDenhardt 溶液 50 ml
20%SDS 2.5 ml
甲酰胺 250 ml
蒸馈水 加至 500 ml
混匀后分装成较小体积，-20°C 保存备用。
HotPrime cDNA Labeling Kit(GenHunterH50)，包括 KlenowDNA 聚合酶（1U/ul)、10X 标记缓冲液、dNTP(—dATP) 或 dNTP(-dCTP)(500umol/L)、中止缓冲液以及蒸馏水
矿物油（可选）
10XMOPS 缓冲液
0.2mol/LMOPS
0.05mol/L 乙酸钠
0.01mol/LEDTA
10XPCR 缓冲液（RNAspectra Differential Display System，F501-F510&R501-R510,PCR-TRAP Cloning System，GenHunter，P404 或 S201)
20XSSC
3mol/LNaCl
0.3mol/L 柠檬酸三钠•2 H20
用 1mol/LHC1 调 pH 至 7.0
1XSSC,1g/L SDS
0.25XSSC,1g/L SDS
20XSSPE
3mol/LNaCl
0.1mol/LNaH2PO4(二代盐）
0.02mol/LEDTA
中止缓冲液（0.lmol/LEDTA,pH8.0)
2. 核酸和寡核苷酸
[a-32P]dATP(3000Ci/umol/L)(1Ci=3.7X1010Bq)
dNTP(250umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHunter P404 或 S501)
Lgh/Rgh 引物（2umol/L)(PCR-TRAP Cloning System，GenHimter P404 或 L201&L202)
鲑鱼精 DNA(GenHunter ML2)
3. 酶和酶缓冲液
Taq DNA 聚合酶（Qiagen201207)
4. 专用设备
离心机
3 mm 滤纸片
增光屏
1.5 ml 离心管
硝酸纤维素膜或尼龙膜
移液器
闪烁计数器
Sephadex G50 柱子（Roche Applied Science 1814419，Indianapolis，IN)
单一感光科学成像胶卷 [推荐 Kodak Biomax MS，No.8715187(Kodak-Eastman，Rochester，NY)]
热循环仪
0.2 ml 薄壁 PCR 管
可透过紫外线的塑料保鲜膜 [推荐 Glad Cling Wrap(The Glad Products Company，Oakland,CA)]
5. 附加试剂
QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit(Qiagen20021)
二、方法
1.cDNA 探针的产生
（1）在每个克隆平板的底部，为每个待分析的四环素抗性菌落编号（推荐每个平板至少选 5 个）。
（2）在 1.5 ml 离心管中，各分装 5ul 菌落裂解缓冲液。
（3）用干净的移液头挑取每个菌落，尽量不要取太多（通常肉眼可见的很小量就足够了）。将细胞转到相应标记的 1.5 ml 离心管中。
（4）将离心管在沸水浴中温育 10min。
（5）以最大速度在室温下离心 2 min，以沉淀细胞残余物。将上清液转到干净的 1.5 ml 离心管中，弃去残余沉淀。
（6）裂解产物立即用于 PCR 分析，或保存在-20°C 备用。
（7）将下列组分加到 0.2 ml 薄壁 PCR 管中，用来做菌落 PCR(强烈推荐先配制一个核心混合液，含有除了菌落裂解液以外的所有组分，这样可以将吸取样品的误差降至最小）。
蒸馏水 10.2ul
10XPCR 缓冲液 2.0ul
dNTP 混合液（250umol/L) 1.6ul
Lgh 引物 2.0ul
Rgh 引物 2.0ul
菌落裂解液 2.0ul
Taq DNA 聚合酶 0.2ul
混合均匀，如果需要加入 30ul 矿物油。
（8）按照下列程序设置热循环仪：94°C 30s → 52°C 40s → 72°C lmin → 30 个循环 → 72°C 5 min(延伸) → 4°C 保温。
（9）在含有溴化乙锭染料的 1.5% 琼脂糖凝胶上，将 20ulPCR 产物全部跑电泳。这不仅可以产生 Northern 印迹分析所用的 cDNA 探针，而且还显示出使用 PCR-TRAP CloningSystem 产生的 cDNA 克隆（见方案 6) 中哪一个含有正确的插入片段。
（10）用 QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit 从琼脂糖凝胶中纯化各条带。纯化片段做模板，用 HotPrime DNA Labeling Kit 产生探针。
（11）如果使用不同的载体进行克隆，要根据厂商的建议产生 Northern 印迹杂交所需的 cDNA 探针。
2.cDNA 探针的标记
（12）如果使用推荐的 HotPrime DNA Labeling Kit，将所有组分完全解冻后，立即置于冰上。
（13）在带有固定帽（这样在煮沸过程中管帽不会松动）的 1.5 ml 离心管中，配制下面的反应体系。
蒸馏水 11ul
10X 标记缓冲液 3ul
用于标记的 DNA 模板（10~50ng) 7ul
（14）将反应混合液在沸水浴中温育10 min。
（15）将反应管在冰上迅速冷却。短暂离心，收集冷凝水。
（16）按照下面的顺序加入反应试剂。
dNTP(-dATP)(500umol/L~undefined 3ul
[a-32P]dATP(3000Ci/mmol/L~undefined 5ul
Klenow DNA 聚合酶 1ul
~undefined如果用 [a-32P]dCTP 代替 [a-32P]dATP, 则用 dNTP(—dCTP) 代替 dNTP(-dATP)。
（17）将混合液在室温放置 20 min, 然后在 37°C 温育 10min。
（18）加入中止缓冲液，混匀。
（19）用 Sephadex G50 柱纯化标记的探针。用带有固定帽的 1.5 ml 离心管收集纯化的探针。在闪烁计数器中，对 1ul 标记的探针进行计数。对大多数标记的 DNA 探针，一共可以获得 1000 万或更多的 cpm。
3. 探针杂交
（20）制备变性琼脂糖（RNA) 凝胶（包括加样与电泳条件，以及 RNA 转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜）的方案，在 Ausubel 等（1995) 及 Sambrook 和 Russell(2001) 中都有介绍。
（21）如果预杂交缓冲液保存在-20°C，则在 37°C 解冻 20 min。
（22）在沸水浴中温育 10 min, 变性鲑鱼精 DNA。
（23）在预杂交溶液中加入鲑鱼精 DNA(终浓度为 100~200ug/ml)，混匀。
（24）用 5 ml 或足够董的预杂交溶液将膜覆盖，在 42°C 下预杂交至少 4 h。
（25）用一个带有固定帽的 1.5 ml 离心管（否则管帽会松动），在水浴中煮沸10min, 以变性纯化的探针。
（26）在冰上冷却 2 min。
（27）离心甩下冷凝水，将探针直接加到预杂交溶液中。
（28）杂交过夜。
（29）小心地倒出放射性的杂交液，在专门盛放放射性废液的容器中处理。
（30）在室温下，用含有1g/LSDS 的 1XSSC 洗涤 2 次。都要在专用的容器中处理洗涤溶液。
（31）用预热的含有1g/L SDS 的 0.25XSSC，在 50~55°C 下漂洗 15~20 min。
4. 印迹曝光
（32）用 3 mm 的滤纸将膜吸干，并用可透过 UV 的塑料薄膜包起来。
（33）将印迹在带有强化屏的单色光胶片下曝光，在-70°C 具有最佳的检测信号。
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