消减 cDNA 或基因组 DNA 文库的制备实验
材料与仪器缓冲液、溶液和试剂 酶和酶缓冲液 核酸和寡核苷酸 放射性化合物 酚热循环仪 水浴箱 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备步骤第1阶段：RNA和DNA的分离一
材料与仪器
缓冲液、溶液和试剂 酶和酶缓冲液 核酸和寡核苷酸 放射性化合物 酚
热循环仪 水浴箱 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
热循环仪 水浴箱 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
步骤
第1阶段：RNA和DNA的分离
一次双向消减，需要总量为2ug的基因组DNA或cDNA。大多数分离RNA和基因组DNA的方法都适用于本实验（Sambrooketal.1989；Chomczynskiand Sacchi 1987；Farrell1993)。如果可能，尽可能使用同样的试剂和方案纯化待比较的样品。如果是基因组DNA作为初始材料，下一步为RsaⅠ 消化（本方案的第3阶段）；如果是RNA作为初始材料，下一步则为cDNA的合成（本方案的第2阶段）。
第2阶段：cDNA的合成
一、材料
1.缓冲液、溶液和试剂
dNTP溶液（10mmol/L)
DTT,0.1mol/L
EDTA,0.2mol/L
第一链缓冲液，5X
矿物油
SSH技术需要很精确的PCR。根据作者的经验，矿物油是维持精确性所必需的.只有在缺乏矿物油而且样品更容易分析时，才使用热盖做大规模的PCR筛选.因此笔者强烈建议，在方案5之前不要使用热盖。
第二链缓冲液，5X
TN缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH7.6，10mmol/LNaCl)
2.酶和酶缓冲液
AMV逆转录酶（20U/ul)
3.核酸和寡核苷酸
cDNA合成引物（10umol/L)
poly(A)+RNA
4.放射性化合物
可选：[a-32P]dCTP(10mCi/ml，3000Ci/mmol)(lCi=3.7X1010Bq)
5.专用设备
热循环仪，或者预设为16°C、42°C和72°C的水浴
6.附加试剂
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂
二、方法
1.第一链cDNA的合成
（1）在0.5ml离心管中，将每个检測和驱动样品与下面的成分混合。
poly(A)+RNA(2ug ） 2~4ul
cDNA合成引物（10umol/L) 1ul
H20 加至5ul
（2）用一滴矿物油覆盖样品表面，在72°C热循环仪或水浴中温育2min。
（3）在室温下冷却2min。
（4）在每个反应管中加入下列成分。
第一链缓冲液，5X 2ul
dNTP溶液（各10mmol/L) 1ul
H2undefined 0.5ul
DTT,0.1mol/L 0.5ul
AMV逆转录酶（20U/u1) 1ul
~undefined可选：要想检测cDNA合成的进程，将0.5ul[a-32P] dCTP(10mCi/ml,3000Ci/mmol)加入到9ul H20中，再取0.5ul稀释的标记物代替上面的H20
（5）轻柔地涡旋混匀，并短暂离心。
（6）在热循环仪或水浴中，将离心管42°C温育90min。
（7）将离心管置于冰上，中止第一链cDNA的合成，并立即进入第二链cDNA的合成。
2.第二链cDNA的合成
（8）将下列成分（在冰上预冷）加到第一链合成管中。
灭菌H2O 48.4ul
第二链缓冲液，5X 16.0ul
dNTP溶液（10mmol/L) 1.6ul
第二链合成酶混合物，20X 4.0ul
（9）混匀并短暂离心，最终体积应该为80ul。
（10）将离心管在16°C(水浴或热循环仪）温育2h。
（11）加入2ul(6U)T4DNA聚合酶，充分混匀。
（12）在水浴或热循环仪中，将离心管16°C再温育30min。
（13）加入4ul 0.2mol/LEDTA,中止第二链的合成。
（14）进行酚：氯仿抽提和乙醇沉淀。
（15）用50ul TN缓冲液重新溶解沉淀。
（16）从上面溶液中取6ul，加到一个新的离心管中，-20°C保存到Rsa I消化之后。
这个样品将进行琼脂糖凝胶电泳，以估计dscDNA合成产物的产量及大小范围。
第 3 阶段：RsaⅠ消化
进行以下操作程序，处理每个实验所用的双链驱动和检测 DNA 样品。这一步产生最适于消减杂交的短的、平末端 dsDNA 片段。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
EDTA,0.2mol/L
TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6,10 mmol/LNaCl)
2. 酶和酶缓冲液
RsaⅠ(10U/ul)
限制缓冲液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
由第 1 阶段获得的基因组 DNA, 或者由第 2 阶段获得的 cDNA, 每个双向消减反应需 2ug
4. 专用设备
水浴，预设为 37°C
5. 附加试剂
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1. 将下列试剂加入上面第 2 阶段 [原文为方案 2(Protocol2)——编者改] 第 8 步的离心管或基因组 DNA(gDNA) 样品中。
ds cDNA 或基因组 DNA 43.5ul
尺似 1 限制缓冲液，10X 5.0ul
RsaⅠ(10U/ul) 1.5ul
2. 混匀，在 37°C 下温育 2~4 h。
3. 检测 RsaⅠ消化的效率，通过 2% 的琼脂糖凝胶电泳分析 5ul 消化产物，用未消化的DNA[第 1 阶段（原文为方案 1--编者改）的基因组 DNA] 作对照。在电泳过程中继续消化，直到对分析结果满意时再中止反应。
4. 加入 2.5ul0.2mol/LEDTA, 中止消化反应。用酚：氯仿抽提，并用乙醇沉淀法收集 DNA。
本步骤不推荐使用糖原或任何类型的共沉淀剂。这些试剂可能提高 DNA 溶液的黏度，并抑制后面的DNA 杂交。同时也应避免使用基于硅介质的 PCR 纯化系统。
5. 每个沉淀用 6ulTN 缓冲液（不用 H20) 溶解，-20°C 保存。驱动 DNA 的制备至此就完成了。
第 4 阶段：接头连接
强烈推荐每一对检测/驱动 DNA 都在两个方向进行消减。设计正向消减是为了富集检测者中存在而驱动者中不存在的差异分子，设计反向消减是为了富集驱动者中存在而检测者中不存在的差异分子。利用正向和反向消减 DNA，对于最终的消减检测者 DNA 文库的差异筛选（方案 6) 是很有用的。检测 DNA 分别与 Adi(检测者 1-1 与 2-1) 和 Ad2R(检测者 1-2 与 2-2) 连接。还应该做一个两个接头（Adi 与 Ad2R) 同检测 DNA(未消减的检测者对照 1-c 和 2-c) 的连接，作为消减反应的负对照。接头不连接驱动 DNA。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
ATP,3 mmol/L
EDTA,0.2mol/L
矿物油
TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6,10 mmol/LNaCl)
2. 酶和酶缓冲液
连接酶缓冲液，10X
T4 DNA 连接酶（400U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
接头 Ad1(10umol/L)
接头 Ad2R(10umol/L)
RsaⅠ消化的检测 DNA
4. 专用设备
水浴，预设 37°C
5. 附加试剂
酚：氯仿抽提和乙酵沉淀所需的试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1. 从上面 RsaⅠ消化过的检测 DNA 中取出 1ul，用 5ul TN 缓冲液稀释。
2. 按照下列成分，为每个反应配制主体连接混合液。
H2O 2ul
连接缓冲液，5X 2ul
ATP(3 mmol/L) 1ul
T4 DNA 连接酶（400U/ul) 1ul
3. 对每一个检测 DNA 混合液，按照所示的顺序，与以下试剂一起加到 0.5 ml 离心管中。吸打溶液，使之彻底混合。
4. 在一个新离心管中，将 2^1 的检测者 1-1 与 24 的检测者 1-2 混合。这是作为非消减的检测者对照 1-c。对于每个检测 DNA 样品，都同样做一个对照。连接之后，在每一个未消减的检测者对照管中，大约有 1/3 的 DNA 分子会被接上两个不同的接头，从而适于使用带有接头的引物进行指数式的 PCR 扩增。
5. 用一滴矿物油覆盖样品，短暂离心后在 16°C 温育过夜。
6. 加入1ul 0.2mol/LEDTA, 中止连接反应。
7.72°C 处理样品 5 min, 使连接酶失活。
8. 从每个未消减检测者对照（1-c，2-c…）中取出1ul，用 1ml TN 缓冲液稀释。这样品将用来做 PCR 扩增（方案 3)。
实验中连接接头的检测 DNA1-1 和 1-2 至此就制备好了。
9. 进入下一部分操作前，先进行连接效率的检测。
第 5 阶段：连接效率检测
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP，每种为 10 mmol/L)
矿物油
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，10X(40 mmol/L Tricine-KOH，22°C 下 pH9.2;3.5 mmol/L 乙酸镁;10 mmol/L 乙酸钾；75 mg/mlBSA，或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X (Advantage2，Clontech，或相当产品）
3. 核酸和寡核苷酸
PCR 引物 P1
未消减对照样品（方案 1 第 4 阶段第 4 步）
4. 专用设备
热循环仪
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1.从每个未消减对照样品中各取 1ul, 分装到 0.5 mlPCR 管中。
2.将以下试剂混合，为所有反应配制主体琨合液。
H2O 19.5ul
PCR 缓冲液，10X 2.5ul
dNTP 溶液（每管 10 mmol/L) 0.5ul
PCR 引物 P1 1.0ul
聚合酶混合液，50X 0.5ul
总体积 24.0ul
3.混匀并短暂离心。
4.第 1 步准备的每个反应管中，各分装 24ul 主体混合液
5.用 1 滴矿物油覆盖样品。
6.将反应混合液放在热循环仪中，72°C 温育 5 min, 以延伸接头。
7.立即进行以下热循环。
8.每管取 4ul, 在 2% 琼脂糖凝胶上进行分析。
重点：这个 PCR 产物应该具有 RsaⅠ消化 DNA 类似的模式。如果 15 个循环后，没有可见的 PCR 产物，要另加 3 个循环，再分析 PCR 产物。如果 21 个循环后还没有可见的 PCR 产物，则需要检査聚合酶混合液的活性。如果聚合酶混合液或其他 PCR 试剂的活性没有问题，应该用新鲜的样品重复连接反应，再进入下一步。
一次双向消减，需要总量为2ug的基因组DNA或cDNA。大多数分离RNA和基因组DNA的方法都适用于本实验（Sambrooketal.1989；Chomczynskiand Sacchi 1987；Farrell1993)。如果可能，尽可能使用同样的试剂和方案纯化待比较的样品。如果是基因组DNA作为初始材料，下一步为RsaⅠ 消化（本方案的第3阶段）；如果是RNA作为初始材料，下一步则为cDNA的合成（本方案的第2阶段）。
第2阶段：cDNA的合成
一、材料
1.缓冲液、溶液和试剂
dNTP溶液（10mmol/L)
DTT,0.1mol/L
EDTA,0.2mol/L
第一链缓冲液，5X
矿物油
SSH技术需要很精确的PCR。根据作者的经验，矿物油是维持精确性所必需的.只有在缺乏矿物油而且样品更容易分析时，才使用热盖做大规模的PCR筛选.因此笔者强烈建议，在方案5之前不要使用热盖。
第二链缓冲液，5X
TN缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH7.6，10mmol/LNaCl)
2.酶和酶缓冲液
AMV逆转录酶（20U/ul)
3.核酸和寡核苷酸
cDNA合成引物（10umol/L)
poly(A)+RNA
4.放射性化合物
可选：[a-32P]dCTP(10mCi/ml，3000Ci/mmol)(lCi=3.7X1010Bq)
5.专用设备
热循环仪，或者预设为16°C、42°C和72°C的水浴
6.附加试剂
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂
二、方法
1.第一链cDNA的合成
（1）在0.5ml离心管中，将每个检測和驱动样品与下面的成分混合。
poly(A)+RNA(2ug ） 2~4ul
cDNA合成引物（10umol/L) 1ul
H20 加至5ul
（2）用一滴矿物油覆盖样品表面，在72°C热循环仪或水浴中温育2min。
（3）在室温下冷却2min。
（4）在每个反应管中加入下列成分。
第一链缓冲液，5X 2ul
dNTP溶液（各10mmol/L) 1ul
H2undefined 0.5ul
DTT,0.1mol/L 0.5ul
AMV逆转录酶（20U/u1) 1ul
~undefined可选：要想检测cDNA合成的进程，将0.5ul[a-32P] dCTP(10mCi/ml,3000Ci/mmol)加入到9ul H20中，再取0.5ul稀释的标记物代替上面的H20
（5）轻柔地涡旋混匀，并短暂离心。
（6）在热循环仪或水浴中，将离心管42°C温育90min。
（7）将离心管置于冰上，中止第一链cDNA的合成，并立即进入第二链cDNA的合成。
2.第二链cDNA的合成
（8）将下列成分（在冰上预冷）加到第一链合成管中。
灭菌H2O 48.4ul
第二链缓冲液，5X 16.0ul
dNTP溶液（10mmol/L) 1.6ul
第二链合成酶混合物，20X 4.0ul
（9）混匀并短暂离心，最终体积应该为80ul。
（10）将离心管在16°C(水浴或热循环仪）温育2h。
（11）加入2ul(6U)T4DNA聚合酶，充分混匀。
（12）在水浴或热循环仪中，将离心管16°C再温育30min。
（13）加入4ul 0.2mol/LEDTA,中止第二链的合成。
（14）进行酚：氯仿抽提和乙醇沉淀。
（15）用50ul TN缓冲液重新溶解沉淀。
（16）从上面溶液中取6ul，加到一个新的离心管中，-20°C保存到Rsa I消化之后。
这个样品将进行琼脂糖凝胶电泳，以估计dscDNA合成产物的产量及大小范围。
第 3 阶段：RsaⅠ消化
进行以下操作程序，处理每个实验所用的双链驱动和检测 DNA 样品。这一步产生最适于消减杂交的短的、平末端 dsDNA 片段。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
EDTA,0.2mol/L
TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6,10 mmol/LNaCl)
2. 酶和酶缓冲液
RsaⅠ(10U/ul)
限制缓冲液，10X
3. 核酸和寡核苷酸
由第 1 阶段获得的基因组 DNA, 或者由第 2 阶段获得的 cDNA, 每个双向消减反应需 2ug
4. 专用设备
水浴，预设为 37°C
5. 附加试剂
酚：氯仿抽提和乙醇沉淀所需的试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1. 将下列试剂加入上面第 2 阶段 [原文为方案 2(Protocol2)——编者改] 第 8 步的离心管或基因组 DNA(gDNA) 样品中。
ds cDNA 或基因组 DNA 43.5ul
尺似 1 限制缓冲液，10X 5.0ul
RsaⅠ(10U/ul) 1.5ul
2. 混匀，在 37°C 下温育 2~4 h。
3. 检测 RsaⅠ消化的效率，通过 2% 的琼脂糖凝胶电泳分析 5ul 消化产物，用未消化的DNA[第 1 阶段（原文为方案 1--编者改）的基因组 DNA] 作对照。在电泳过程中继续消化，直到对分析结果满意时再中止反应。
4. 加入 2.5ul0.2mol/LEDTA, 中止消化反应。用酚：氯仿抽提，并用乙醇沉淀法收集 DNA。
本步骤不推荐使用糖原或任何类型的共沉淀剂。这些试剂可能提高 DNA 溶液的黏度，并抑制后面的DNA 杂交。同时也应避免使用基于硅介质的 PCR 纯化系统。
5. 每个沉淀用 6ulTN 缓冲液（不用 H20) 溶解，-20°C 保存。驱动 DNA 的制备至此就完成了。
第 4 阶段：接头连接
强烈推荐每一对检测/驱动 DNA 都在两个方向进行消减。设计正向消减是为了富集检测者中存在而驱动者中不存在的差异分子，设计反向消减是为了富集驱动者中存在而检测者中不存在的差异分子。利用正向和反向消减 DNA，对于最终的消减检测者 DNA 文库的差异筛选（方案 6) 是很有用的。检测 DNA 分别与 Adi(检测者 1-1 与 2-1) 和 Ad2R(检测者 1-2 与 2-2) 连接。还应该做一个两个接头（Adi 与 Ad2R) 同检测 DNA(未消减的检测者对照 1-c 和 2-c) 的连接，作为消减反应的负对照。接头不连接驱动 DNA。
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
ATP,3 mmol/L
EDTA,0.2mol/L
矿物油
TN 缓冲液（10 mmol/LTris-HCl、pH7.6,10 mmol/LNaCl)
2. 酶和酶缓冲液
连接酶缓冲液，10X
T4 DNA 连接酶（400U/ul)
3. 核酸和寡核苷酸
接头 Ad1(10umol/L)
接头 Ad2R(10umol/L)
RsaⅠ消化的检测 DNA
4. 专用设备
水浴，预设 37°C
5. 附加试剂
酚：氯仿抽提和乙酵沉淀所需的试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1. 从上面 RsaⅠ消化过的检测 DNA 中取出 1ul，用 5ul TN 缓冲液稀释。
2. 按照下列成分，为每个反应配制主体连接混合液。
H2O 2ul
连接缓冲液，5X 2ul
ATP(3 mmol/L) 1ul
T4 DNA 连接酶（400U/ul) 1ul
3. 对每一个检测 DNA 混合液，按照所示的顺序，与以下试剂一起加到 0.5 ml 离心管中。吸打溶液，使之彻底混合。
4. 在一个新离心管中，将 2^1 的检测者 1-1 与 24 的检测者 1-2 混合。这是作为非消减的检测者对照 1-c。对于每个检测 DNA 样品，都同样做一个对照。连接之后，在每一个未消减的检测者对照管中，大约有 1/3 的 DNA 分子会被接上两个不同的接头，从而适于使用带有接头的引物进行指数式的 PCR 扩增。
5. 用一滴矿物油覆盖样品，短暂离心后在 16°C 温育过夜。
6. 加入1ul 0.2mol/LEDTA, 中止连接反应。
7.72°C 处理样品 5 min, 使连接酶失活。
8. 从每个未消减检测者对照（1-c，2-c…）中取出1ul，用 1ml TN 缓冲液稀释。这样品将用来做 PCR 扩增（方案 3)。
实验中连接接头的检测 DNA1-1 和 1-2 至此就制备好了。
9. 进入下一部分操作前，先进行连接效率的检测。
第 5 阶段：连接效率检测
一、材料
1. 缓冲液、溶液和试剂
dNTP 溶液（包含所有 4 种 dNTP，每种为 10 mmol/L)
矿物油
2. 酶和酶缓冲液
PCR 缓冲液，10X(40 mmol/L Tricine-KOH，22°C 下 pH9.2;3.5 mmol/L 乙酸镁;10 mmol/L 乙酸钾；75 mg/mlBSA，或者厂商提供）
聚合酶混合液，50X (Advantage2，Clontech，或相当产品）
3. 核酸和寡核苷酸
PCR 引物 P1
未消减对照样品（方案 1 第 4 阶段第 4 步）
4. 专用设备
热循环仪
5. 附加试剂
琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备
二、方法
1.从每个未消减对照样品中各取 1ul, 分装到 0.5 mlPCR 管中。
2.将以下试剂混合，为所有反应配制主体琨合液。
H2O 19.5ul
PCR 缓冲液，10X 2.5ul
dNTP 溶液（每管 10 mmol/L) 0.5ul
PCR 引物 P1 1.0ul
聚合酶混合液，50X 0.5ul
总体积 24.0ul
3.混匀并短暂离心。
4.第 1 步准备的每个反应管中，各分装 24ul 主体混合液
5.用 1 滴矿物油覆盖样品。
6.将反应混合液放在热循环仪中，72°C 温育 5 min, 以延伸接头。
7.立即进行以下热循环。
8.每管取 4ul, 在 2% 琼脂糖凝胶上进行分析。
重点：这个 PCR 产物应该具有 RsaⅠ消化 DNA 类似的模式。如果 15 个循环后，没有可见的 PCR 产物，要另加 3 个循环，再分析 PCR 产物。如果 21 个循环后还没有可见的 PCR 产物，则需要检査聚合酶混合液的活性。如果聚合酶混合液或其他 PCR 试剂的活性没有问题，应该用新鲜的样品重复连接反应，再进入下一步。
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