引物设计和末端标记实验

激酶缓冲液 MgCl2 二硫苏糖醇 牛血清白蛋白 ddH20 TE 缓冲液 EDTA 聚核苷酸激酶引物 放射性化合物
放射性化合物离心机和转子 丙烯酸防护板 离心管架 废弃物容器 盖革计数器 QuickSpin 柱

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

5X 激酶缓冲液

0.25mol/LTris-HCl,pH9

0.05mol/LMgCl2

0.05mol/L 二硫苏糖醇（DTT)

0.25 mg/ml 牛血清白蛋白（BSA)

-20°C 储存

灭菌重蒸水（ddH20)

TE 缓冲液，pH8.0

10 mmol/LTris-HCl,pH8.0

1mmol/LEDTA，pH8.0

2. 酶和酶缓冲液

聚核苷酸激酶，10U/ul(Roche)

3. 核酸和寡核苷酸

寡核苷酸引物

4. 放射性化合物

[y-32P]ATP6000Ci/mmol/L(lCi=3.7X1010Bq)(PerkinElmerLifeSciences)

也可用 [y-33P]ATP, 它相对于 [y-32P]ATP 危险性稍微小一些，并具有更长的半衰期，但是更贵。

5. 离心机和转子

用翻转吊桶式转子离心，15 ml 锥形管的适配器

6. 专用设备

丙烯酸防护板、离心管架（「betablock」）和废弃物容器

离心管架（例如 3008-1000fromUSAScientific)

收集管（1.5 ml，包括快速离心柱）

冷却块（coolingblock)

锥形管，15 ml

盖革计数器（Geigercounter,—种放射能测定器）

离心管，0.5 ml，灭过菌

QuickSpin 柱（TE：),G-25 葡聚糖凝胶（Sephadex) 柱，用于放射性标记 DNA 的纯化(Roche)

水浴

二、方法

1. 用灭菌 ddH20 将引物稀释至10umol/L。所购买的引物是以 50nmol/L 等级合成的收到时呈冻干粉状。用 PH8.0 的 TE 缓冲液将干粉溶解后，作为储存液保存。使用前将其稀释成 10umol/L 的工作溶液，分装成小份，冻存于-20°C。

2. 选择一个引物进行末端标记。在冰上融化引物和 5X 激酶缓冲液。酶在加入反应体之前都要放在冰柜里，也可以用台式冷却块使酶维持在-20°C。在室温下融化同位素，需将丙烯酸防护板挡在前面。

3. 在冰上将 3ul 灭菌 ddH20、5.6ul5X 激酶缓冲液、12ul 10mol/L 引物和 1.4ul 聚苷酸激酶加入到灭菌的 0.5 ml 离心管中，将冰盒放在丙烯酸防护板后面，加入 6ul[y-32P] ATP(6000Ci/mmol/L)。混匀，盖上盖子，37°C 水浴上温育 1~2 h。

4. 在温育的最后 10min 准备 QuickSpin 柱。将柱子反复颠倒混匀，除去管帽和顶盖放入收集管内。将柱子/收集管组件置于 15 ml 锥形管中，在台式离心机中以 1100 g 离心2 min。倒干收集管再离心一次。在装入末端标记的反应混合物之前，转移柱到另一干净的收集管中。

5. 温育完成之后，将末端标记反应混合物在离心机上短暂离心。加入 52ul 灭菌 ddH20,移液器吹打混匀，转移所有溶液到离心柱上纯化（比如除去未利用的核苷酸)。

6.1100 g 离心 4 min。

7. 从收集管上将柱子取下，并扔入适当的放射性废弃物容器中。盖上收集末端标记物的收集管的盖子。继续 PCR 方案（方案 2) 或将引物放在试管架上于-20°C 冻存。