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PCR技术

模板 DNA 的准备、实验的组织和 PCR 扩增实验

2024-05-16 PCR技术 加入收藏
材料与仪器PCR 缓冲液 ddH20 基因组 DNA dNTP 寡核苷酸引物离心机和转子 丙烯酸防护板 过滤阻挡吸头 多道移液器 PCR 仪 托盘 固定器装置

材料与仪器

PCR 缓冲液 ddH20 基因组 DNA dNTP 寡核苷酸引物
离心机和转子 丙烯酸防护板 过滤阻挡吸头 多道移液器 PCR 仪 托盘 固定器装置 底座管盖小管

步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

含 15 mmol/LMgCl2 的 10XPCR 缓冲液 (GeneAmpPCR 缓冲液 I,AppliedBiosystems)

灭过菌的 ddH20

2. 酶和酶缓冲液

TaqDNA 聚合酶,(AppliedBiosystems 或 Invitrogen)

3. 核酸和寡核苷酸

基因组 DNA

10 mmol/L dNTP(GeneAmpPCRdNTP 混合物,AppliedBiosystems)

寡核苷酸引物(Invitrogen 公司合成,稀释成 lOumol/L)

4. 离心机和转子

用翻转吊桶式转子和微板适配器离心

5. 专用设备

丙烯酸防护板(acrylicshield)

过滤阻挡吸头(filterbarriertips)

多道移液器(Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)

PCR 仪,96 孔(AppliedBiosystemsGeneAmp9700)

托盘/固定器装置和底座,96 孔(AppliedBiosystems)

管盖,一条 8 个(USAScientific 或 AppliedBiosystems)

小管,0.2 ml,一条 8 个(USAScientific 或 AppliedBiosystems)

二、方法

1. 在冰上融化 dNTP、10XPCR 缓冲液和未标记的引物。Taq 酶在加入反应混合物之前应保存在-20°C。在丙烯酸防护板后融化标记的引物。

2. 每一个反应的混合物包括:

灭菌 ddH20                                       6.95ul

含 MgCl2 的 10XPCR 缓冲液            1.25ul

10mmol/LdNTP                                  0.25ul

10mmol/L 未标记引物                        0.5ul

标记引物                                            0.5ul

在优化实验条件过程中,如果 PCR 产物的放射信号强度太低,可以增加标记引物的用量,同时按相应

比例调整 ddH20 的体积。

TaqDNA 聚合酶(终浓度为 0.25U)     0.05ul

对于一个 96 孔微孔板,准备用于 100 个反应的混合物。

3. 混匀,按等份加入放置在冰上的 PCR 板中(9.5ul/样品)。

4. 用多道移液器加入 3ulDNA(60ng),混匀。

5. 把盖子盖紧,将板放入预热到 94°C 的 PCR 仪中。

6. 如果产物大小是 200bp, 扩增 30 个循环。循环参数如下:94°C 初始变性 5 min;30个循环的 94°C 变性 30s; 根据经验确定的退火温度(Tm) 退火 30s;72°C 延伸 30s。最后一步 72°C 延伸 7 min。值可以通过引物序列计算出来,公式为 2(A+T)+4(G+C)。

7. 扩增完成后,将样品于-20°C 冻存,或者直接进入方案 3。


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