单链 cDNA 的合成实验

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去除 RNA 酶的双蒸水

10XRT-PCR 缓冲液（去除 RNA 酶的双蒸水，100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

2. 酶和酶缓冲液

MMLV 逆转录酶（100~200U/ul)

SUPERaseINRNA 酶抑制剂（20U/ul;Ambion)

3. 核酸和寡核苷酸

dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)

随机引物（5umol/L)

总 RNA(达到 2.5ug)

4. 实验器材

薄壁的 PCR 管

二、方法

1. 在冰上加 2ul50umol/L 的随机引物到薄壁的 PCR 管中（一个反应一管)。

2. 加入 2.5ug 的总 RNA。

3. 加入 4ul 的 10 mmol/LdNTP 混合物。

4. 添加去除 RNA 酶的双蒸水（RNaSe-freeH20)，使体积达到 16ul。

5.70°C 加热 10min, 变性二级结构，然后立即放在冰上。

6. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。

7. 加1ul 的 20U/ulSUPERaselN。

8. 加1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。

9.42°C 温浴 1h。

10.95°C 加热10min, 灭活逆转录酶。

11. 继续扩增步骤或停止反应，-2°C 储存。