甲基化PCR检测方法

一、基因组DNA的提取

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：

1. 蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20 mg/ml；

2. RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10 mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20℃保存。

3. 验证提取DNA的纯度的方法有二：

（1）紫外分光光度计计算OD比值；

（2）1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

二、亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。

1. 将约2 ug DNA于1.5 ml EP管中使用DDW稀释至50 ul；

2. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH；

3. 42℃水浴30 min；

水浴期间配制：

4. 10 mM 对苯二酚（氢醌），加30 ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5. 3.6 M 亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88 g 亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3 M NaOH滴定溶液至pH 5.0，最终体积为5 ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。pH一定要准确为5.0。加520 ul 至上述水浴后溶液中。

6. EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

7. 加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。

8. 50℃避光水浴16 h。

一般此步在4 pm开始做，熟练的话不到5 pm即可完成，水浴16 h正好至次日8 am以后收，时间上很合适。

这一步细节：

（1）基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

（2）所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

（3）亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。

（4）水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

三、修饰后DNA纯化回收

EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。

1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5ml EP管中。

2. 以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）

（1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；

（2）加1 ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；

（3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3 ml~5 ml 注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2 ml 以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

（4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2 ml 80%的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。

（5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5 ml 洁净EP管上，离心12 000 rpm，2 min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。

（6）将小柱取下置于另一洁净1.5 ml EP管上，移液器加50 ul 预热好的DDW，室温放置5 min。

（7）离心12 000 rpm，20 s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50 ul。

3. 加5.5 ul 新鲜配制的3 M NaOH，室温放置15 min。

4. 加33 ul 10 M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右。

5. 加4 ul 10 mg/ml 糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧

6. 加270 ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧。

7. 4度，12 000 rpm 离心，30 min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。

8. 加500 ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12 000 rpm，5 min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。

9. 倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5 min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20 ul~30 ul DDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。

10. -20℃保存DNA溶液。

此步细节：

（1）在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。

（2）乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。

（3）异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。

此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的pH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。