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PCR技术

从悬浮细胞中制备用于DMS足迹分析的基因组DNA

2024-05-15 PCR技术 加入收藏
原理材料与仪器悬浮培养细胞PBS 裂解液 100%硫酸二甲酯(DMS) 100%乙醇 室温50 mL螺口聚丙烯管(如Coming公司产品) 台式离心机步骤1)

原理



材料与仪器

悬浮培养细胞
PBS 裂解液 100%硫酸二甲酯(DMS) 100%乙醇 室温
50 mL螺口聚丙烯管(如Coming公司产品) 台式离心机

步骤


1) 在50 mL螺口聚丙烯管中分别准备3份49 mL PBS,用前置于冰上预冷至少30 min。配制裂解液并且在15 mL螺口聚丙烯管中准备3份2.7 mL裂解液。


2) 将2份含有0.5×108〜1×l08细胞的培养液转移至50 mL聚丙烯管中,在台式离心 机上室温500 g (在IEC Centra-7R离心机上为1500r/min)离心5 min,吸出并弃上清。留下足以将细胞重悬至1 mL终体积的培养液,用手指弹击管底部,或用移液器轻轻地上下抽吸以重悬细胞。


3) 对于对照(未处理的)悬浮细胞:将1 mL重悬细胞加入1份49 mL冰冷的PBS溶液中,轻轻颠倒以充分混合,于4℃ 500 g离心5 min,然后进行步骤8。


4) 对于DMS处理悬浮细胞:将1 mL重悬细胞转移到L 5 mL微量离心管中,然后在通风橱中的37℃水浴中保温。


5) 将10μL室温100% DMS加入到90μL100%乙醇制备10%的DMS溶液。在涡旋混 合器上振荡25 s以充分混匀,稍加离心,收集液滴。10%的DMS用乙醇配制是由于该浓度的DMS不溶于水。


6) 加入10μL 10%的DMS溶液于保温的细胞中,轻轻颠倒以混匀,37℃温育1 min。 立即将细胞加入到冰冷的1份49 mL PBS溶液中,轻轻颠倒以混匀,于4℃500 g离心 5 min。此处所列出的DMS的用量及温育时间,适用于作为预备试验的出发条件,为得到最佳的DMS足迹,可能有必要对它们进行修正。


7) 吸出并弃上清。然后从第3份冰冷的PBS溶液中取1〜5 mL将细胞迅速重悬,立即加入冰冷的PBS到50 mL管中,轻轻颠倒以混合。在4℃ 500 g离心5 min。


8) 对于对照细胞和处理细胞:吸出并弃上清。细胞重悬于300μL冰冷的PBS,然后转移到独立的每份2.7 mL的裂解液中,轻轻颠倒以混合。继续DNA提取步骤,并进行对照DNA的DMS处理及哌啶断裂


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