cDNA文库组标准流程

第一部分 Total RNA 的提取

一、 试剂配制

准备工作：

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：

▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5

三水合柠檬酸纳 22.94g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠：

肌氨酸钠 10g

加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲变性裂解液：

0.78M柠檬酸钠 8.25ml

10%肌氨酸钠 12.375ml

异硫氰酸胍 118.05g

加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用

临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）

▲2M 醋酸钠 PH=4.5

NaAc・3H2O 13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲3M醋酸钠PH=5

NaAc・3H2 O 20.4g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用

▲ 4M LiCL:

LiCL 24.164g

加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用

▲0.5M EDTA PH=8.0

EDTA 18.61g

用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用

▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):

MOPS 41.86g

NaAC・3H2O 4.10g

0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。

▲1x MOPS:

10x MOPS 30ml

加DEPC水270ml，用时现配。

▲4x RNA Loading buffer:

10x MOPS 400ul

甘油（高压过） 200UL

溴酚兰 10ul

甲醛(37%) 72ul

去离子甲酰氨 310ul

EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul

ErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul

在4℃ 可保持3个月

▲10x PBS

pH=7.4

NaCl 80g

KCl 2g

Na2HPO4 14.4g

KH2PO4 2.4g

定容至1000ml

▲变性电泳胶：

称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液：

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml