抑制细菌转录终止检测技术筛选RNA结合蛋白实验
原理一种通过筛选重组 cDNA 文库研究多肽与 RNA 相互作用的细菌抗转录终止检测系统。材料与仪器N-表达质粒 E.coil N567 感受态细菌储存液 缓冲
原理
一种通过筛选重组 cDNA 文库研究多肽与 RNA 相互作用的细菌抗转录终止检测系统。
材料与仪器
N-表达质粒 E.coil N567 感受态细菌
储存液 缓冲液
蛋白胨培养基 蛋白胨平板 N-表达质粒组合文库 培养板
储存液 缓冲液
蛋白胨培养基 蛋白胨平板 N-表达质粒组合文库 培养板
步骤
―、材料与设备
1. 通过比较 β-半乳糖苷酶表达差异导致的细菌克隆颜色变化检测多肽与 RNA 间的作用
(1) 储存液：氨苄青霉素（100 mg/ml)，氯霉素（40 mg/ml，甲醇溶液），X-Gal（40 mg/ml，二甲基甲酰胺溶液），IPTG（100 mmol/L），可在 -20℃ 保存数月。
(2) 蛋白胨培养基：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，定容 1 L，灭菌后保存。
(3) 蛋白胨平板：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，15 g 琼脂粉，定容至 1 L，高压灭菌；冷却后加入 50 μg/ml 氨苄青霉素，15 μg/ml 氯霉素，80 μg/ml X-Gal，50 μmol/L IPTG。
(4) N-表达质粒（pBR322-衍生的，具氨芐青霉素抗性），N-报道基因表达质粒 ( pACYCJ84-衍生的，具氯霉素抗性）。
(5) E.coil N567 感受态细菌，分别含有 N-表达质粒和 N-报道质粒（CaCl2 法制备）。
2. 通过 β-半乳糖苷酶活性检测定量比较多肽与 RNA 间的相互作用
(1) 储存液：1 mol/L 葡萄糖，1 mg/ml 维生素 B1，1 mol/L MgSO4，0.2 μm 滤膜过滤除菌；4 mg/ml 邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（O nitrophrny-β-D-garactopyranoside，ONPG）溶解于 A 溶液，4℃ 保存；1 mol/L NaCO3，0.1% SDS，氯仿。
(2) A 溶液：1.5 g K3HPO4，4.5 g KH2PO4，1.0 g (NH4)2SO4，0.5 g 柠檬酸钠2H2O，加水定容至 1 L，高压灭菌后保存。
(3) Z 缓冲液：0.06 mol/L Na2HPO4，0.01 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L KCl，0.001 mol/L MgSO4，0.05 mol/L β-巯基乙醇。
3. 重组库的制备
(1) 储存液：200 mmol/L DTT ( -20℃ 保存）；2.5 mmol/L dNTP 混合物（-20℃ 保存）；0.5 mol/L EDTA，pH 8.0；酚：氯仿：异戊醇（25：24：1 ) 溶液；3 mol/L 乙酸钠 ( pH 5.2）；50X TAE ( 242 g Tris 碱，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA，加水定容至 1 L）。
(2) 20 μmol/L 含随机 DNA 序列库的简并寡核苷酸，末端为固定序列，5' 端和 3' 端分别带有 NcoⅠ 和 BsmⅠ 酶切位点。
(3) 20 μmol/L 末端与简并寡核苷酸 3' 端固定序列互补的引物寡核苷酸。
(4) 酶及公司附带的缓冲液：NcoⅠ（10 U/μl），BsmⅠ（5 U/μl），测序酶 2.0（13 U/μl），T4 DNA 连接酶（1 U/μl）。
4. 从随机重组库中筛选新的 RNA 结合多肽
(1) N-表达质粒组合文库（N-cxpressor plasmid combinatorial library )。
(2) E.coli N567 感受态（含报道基因的表达质粒）。
(3) 蛋白胨培养基，平板，氨苄青霉素（100 mg/ml )，氯霉素（40 mg/ml )，甲醇溶液。
(4) 灭菌的 96 孔培养板。
二、操作方法
1. 通过比较 β-半乳糖苷酶表达差异导致的细菌克隆颜色变化检测多肽与 RNA 间的作用
(1) 以 pBR N-表达质粒转化 N567/pAC 报道菌：取 10 ng（1~10 μl）的 pBR 质粒与 50~100 μl 的感受态报道菌混匀，冰浴 10 min，37℃ 2 min 后快速转移至冰浴，然后加入 0.5~1 ml 的蛋白胨培养液，37°C 振摇 1 h。
(2) 取 1/5~1/10 的转化混合物涂布于含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培养板，34℃ 培养 48 h。
(3) 通过与阳性/阴性对照进行颜色比较，采用半定量评分的方法对抗转录终止活性进行检测：含野牛型 nut 报道质粒而不含 N-表达质粒的阴性对照菌株评分为 0；同时含野生型 nut 报道质粒和 N-表达质粒的阳性对照菌株评分为 + + + + +。
2. 通过 β-半乳糖苷酶活性检测定量比较多肽 RNA 间的相互作用
(1) 挑取单个蓝色的细菌克隆，用含有相应抗生素的蛋白胨培养液 37℃ 培养过夜。
(2) 稀释 50 倍过夜培养物至 3~5 ml 培养液（含 22.4 mmol/L 葡萄糖，1 μg/ml 维生素 B1，1 mmol/L MgSO4 及抗生素）中。37℃ 振摇培养至 OD600 约为 0.2 ( 3~6 h)。加终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG，继续培养至 OD600 达 0.4~0.5，测定并记录 OD600 值。
(3) 混合 0.1 ml 的细菌培养物和 0.9 ml 的 Z 缓冲液，并加入 25 μl 的氯仿和 12 μl 的 0.1% SDS，剧烈振荡 10 s 混匀，此时溶液应变混。10~15 s 后加入的 ONPG 溶液，于 28°C 孵育。
(4) 当溶液变黄时，加入 0.4 ml 1 mol/L NaCO3，终止反应。记录从加入 ONPG 至反应终止的时间。
(5) 于 11000 g 离心 1 min 去沉淀，读取 OD420 和 OD550 数值，用公式计算 β-半乳糖苷酶活性，酶活力=1000X（OD420一1.6XOD550）/（tX0.1XOD600），t=反应时间。
3. 重组库的制备
(1) 取 20 μl 寡核苷酸引物、15 μl 简并寡核苷酸、100 μl 测序酶缓冲液和 272.3 μl 水，混匀。加热至 65℃ 再缓慢冷至室温使引物与简并寡核苷酸退火。
(2) 再加入 25 μl DTT、60 μl dNTP 混合物、7.7 μl (100 U) 测序酶，37℃ 孵育 20 min。加入 4 μl EDTA 终止反应。（在加入测序酶前留取少量样品以便通过 4% 琼脂糖凝胶电泳与延伸产物比较。）
(3) 加 500 μl 酚：氯仿：异戊醇溶液，剧烈混匀，11000 g 离心 1 min，取上层水相至一干净离心管内；加 500 μl 氯仿，剧烈混匀，11000 g 离心 1 min，取上层水相至一干净离心管。用 1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA。
(4) 用 290 μl 水，50 μl NEB 缓冲液 2 和 40 μl DTT 溶解 DNA ( 留取少量样品以便通过 4% 琼脂糖凝胶电泳与酶切产物比较）。加 40 μl NcoⅠ，37°C 反应 2 h ( 留取少量样品）；加 80 μl BsmⅠ，65℃ 反应 2 h ( 留取少量样品）。按前面操作同样进行酚抽提和乙醇沉淀，4% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切程度。
(5) 用 12%、1.6 mm 丙烯酰胺胶分离酶切的 DNA，切下相应胶条，用 300 mmol/L 乙酸钠洗脱 DNA 后用 2.5 倍体积乙醇沉淀。
(6) 对于 20 μl 体积的连接反应，加入 50 ng NcoⅠ和 BsmⅠ消化的质粒、5 ng 待插入的 DNA ( 上一步操作获得）、1X 连接缓冲液、2 μl T4 DNA 连接酶。将连接混合物转化 N567 菌株。转化菌的接种密度保持在每个直径为 100 mm 的平板上含 2000~3000 个克隆最佳。
4. 从随机重组库中筛选新的 RNA 结合多肽
(1) 初筛：取制备好的重组库（200 μl 的连接产物）加入 1.5 ml 的感受态报道细胞，涂布于直径为 150 mm 的含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培养板。挑取蓝色克隆（即便是较弱的蓝色克隆也予以挑取），分别重悬于 96 孔板内（每孔加 100 μl 含抗生素的蛋白胨培养液）。细菌培养过夜至生长平台期，合并收集细菌，碱裂解法结合琼脂糖凝胶电泳纯化获取 pBR 质粒。
(2) 二次筛选（排除报道质粒自发突变造成的假阳性）：将获得的阳性质粒共同转化报道细胞，涂板筛选，挑取阳性克隆接种于 3 ml 含氨苄青霉素的蛋白胨培养液中，过夜培养至生长平台，分別提取各个克隆的质粒。
(3) 第三次筛选 ( 排除与靶 RNA 非特异结合造成的假阳性）：将获得的阳性质粒分別同时转化含特异性报道质粒的菌株和含非特异性报道质粒的菌株，排除在两类菌株中都能激活报道基因的克隆。
(4) 第四次筛选（排除表达质粒上随机库以外的其他部位的碱基突变产生的假阳性）：对第三次筛选得到的阳性克隆进行测序，然后按测序结果再合成阳性序列，重新克隆人 pBR，再进行一次抗转录终止检测。
1. 通过比较 β-半乳糖苷酶表达差异导致的细菌克隆颜色变化检测多肽与 RNA 间的作用
(1) 储存液：氨苄青霉素（100 mg/ml)，氯霉素（40 mg/ml，甲醇溶液），X-Gal（40 mg/ml，二甲基甲酰胺溶液），IPTG（100 mmol/L），可在 -20℃ 保存数月。
(2) 蛋白胨培养基：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，定容 1 L，灭菌后保存。
(3) 蛋白胨平板：10 g 蛋白胨，5 g NaCl，15 g 琼脂粉，定容至 1 L，高压灭菌；冷却后加入 50 μg/ml 氨苄青霉素，15 μg/ml 氯霉素，80 μg/ml X-Gal，50 μmol/L IPTG。
(4) N-表达质粒（pBR322-衍生的，具氨芐青霉素抗性），N-报道基因表达质粒 ( pACYCJ84-衍生的，具氯霉素抗性）。
(5) E.coil N567 感受态细菌，分别含有 N-表达质粒和 N-报道质粒（CaCl2 法制备）。
2. 通过 β-半乳糖苷酶活性检测定量比较多肽与 RNA 间的相互作用
(1) 储存液：1 mol/L 葡萄糖，1 mg/ml 维生素 B1，1 mol/L MgSO4，0.2 μm 滤膜过滤除菌；4 mg/ml 邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（O nitrophrny-β-D-garactopyranoside，ONPG）溶解于 A 溶液，4℃ 保存；1 mol/L NaCO3，0.1% SDS，氯仿。
(2) A 溶液：1.5 g K3HPO4，4.5 g KH2PO4，1.0 g (NH4)2SO4，0.5 g 柠檬酸钠2H2O，加水定容至 1 L，高压灭菌后保存。
(3) Z 缓冲液：0.06 mol/L Na2HPO4，0.01 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L KCl，0.001 mol/L MgSO4，0.05 mol/L β-巯基乙醇。
3. 重组库的制备
(1) 储存液：200 mmol/L DTT ( -20℃ 保存）；2.5 mmol/L dNTP 混合物（-20℃ 保存）；0.5 mol/L EDTA，pH 8.0；酚：氯仿：异戊醇（25：24：1 ) 溶液；3 mol/L 乙酸钠 ( pH 5.2）；50X TAE ( 242 g Tris 碱，57.1 ml 冰乙酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA，加水定容至 1 L）。
(2) 20 μmol/L 含随机 DNA 序列库的简并寡核苷酸，末端为固定序列，5' 端和 3' 端分别带有 NcoⅠ 和 BsmⅠ 酶切位点。
(3) 20 μmol/L 末端与简并寡核苷酸 3' 端固定序列互补的引物寡核苷酸。
(4) 酶及公司附带的缓冲液：NcoⅠ（10 U/μl），BsmⅠ（5 U/μl），测序酶 2.0（13 U/μl），T4 DNA 连接酶（1 U/μl）。
4. 从随机重组库中筛选新的 RNA 结合多肽
(1) N-表达质粒组合文库（N-cxpressor plasmid combinatorial library )。
(2) E.coli N567 感受态（含报道基因的表达质粒）。
(3) 蛋白胨培养基，平板，氨苄青霉素（100 mg/ml )，氯霉素（40 mg/ml )，甲醇溶液。
(4) 灭菌的 96 孔培养板。
二、操作方法
1. 通过比较 β-半乳糖苷酶表达差异导致的细菌克隆颜色变化检测多肽与 RNA 间的作用
(1) 以 pBR N-表达质粒转化 N567/pAC 报道菌：取 10 ng（1~10 μl）的 pBR 质粒与 50~100 μl 的感受态报道菌混匀，冰浴 10 min，37℃ 2 min 后快速转移至冰浴，然后加入 0.5~1 ml 的蛋白胨培养液，37°C 振摇 1 h。
(2) 取 1/5~1/10 的转化混合物涂布于含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培养板，34℃ 培养 48 h。
(3) 通过与阳性/阴性对照进行颜色比较，采用半定量评分的方法对抗转录终止活性进行检测：含野牛型 nut 报道质粒而不含 N-表达质粒的阴性对照菌株评分为 0；同时含野生型 nut 报道质粒和 N-表达质粒的阳性对照菌株评分为 + + + + +。
2. 通过 β-半乳糖苷酶活性检测定量比较多肽 RNA 间的相互作用
(1) 挑取单个蓝色的细菌克隆，用含有相应抗生素的蛋白胨培养液 37℃ 培养过夜。
(2) 稀释 50 倍过夜培养物至 3~5 ml 培养液（含 22.4 mmol/L 葡萄糖，1 μg/ml 维生素 B1，1 mmol/L MgSO4 及抗生素）中。37℃ 振摇培养至 OD600 约为 0.2 ( 3~6 h)。加终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG，继续培养至 OD600 达 0.4~0.5，测定并记录 OD600 值。
(3) 混合 0.1 ml 的细菌培养物和 0.9 ml 的 Z 缓冲液，并加入 25 μl 的氯仿和 12 μl 的 0.1% SDS，剧烈振荡 10 s 混匀，此时溶液应变混。10~15 s 后加入的 ONPG 溶液，于 28°C 孵育。
(4) 当溶液变黄时，加入 0.4 ml 1 mol/L NaCO3，终止反应。记录从加入 ONPG 至反应终止的时间。
(5) 于 11000 g 离心 1 min 去沉淀，读取 OD420 和 OD550 数值，用公式计算 β-半乳糖苷酶活性，酶活力=1000X（OD420一1.6XOD550）/（tX0.1XOD600），t=反应时间。
3. 重组库的制备
(1) 取 20 μl 寡核苷酸引物、15 μl 简并寡核苷酸、100 μl 测序酶缓冲液和 272.3 μl 水，混匀。加热至 65℃ 再缓慢冷至室温使引物与简并寡核苷酸退火。
(2) 再加入 25 μl DTT、60 μl dNTP 混合物、7.7 μl (100 U) 测序酶，37℃ 孵育 20 min。加入 4 μl EDTA 终止反应。（在加入测序酶前留取少量样品以便通过 4% 琼脂糖凝胶电泳与延伸产物比较。）
(3) 加 500 μl 酚：氯仿：异戊醇溶液，剧烈混匀，11000 g 离心 1 min，取上层水相至一干净离心管内；加 500 μl 氯仿，剧烈混匀，11000 g 离心 1 min，取上层水相至一干净离心管。用 1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠和 2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA。
(4) 用 290 μl 水，50 μl NEB 缓冲液 2 和 40 μl DTT 溶解 DNA ( 留取少量样品以便通过 4% 琼脂糖凝胶电泳与酶切产物比较）。加 40 μl NcoⅠ，37°C 反应 2 h ( 留取少量样品）；加 80 μl BsmⅠ，65℃ 反应 2 h ( 留取少量样品）。按前面操作同样进行酚抽提和乙醇沉淀，4% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切程度。
(5) 用 12%、1.6 mm 丙烯酰胺胶分离酶切的 DNA，切下相应胶条，用 300 mmol/L 乙酸钠洗脱 DNA 后用 2.5 倍体积乙醇沉淀。
(6) 对于 20 μl 体积的连接反应，加入 50 ng NcoⅠ和 BsmⅠ消化的质粒、5 ng 待插入的 DNA ( 上一步操作获得）、1X 连接缓冲液、2 μl T4 DNA 连接酶。将连接混合物转化 N567 菌株。转化菌的接种密度保持在每个直径为 100 mm 的平板上含 2000~3000 个克隆最佳。
4. 从随机重组库中筛选新的 RNA 结合多肽
(1) 初筛：取制备好的重组库（200 μl 的连接产物）加入 1.5 ml 的感受态报道细胞，涂布于直径为 150 mm 的含有抗生素、X-Gal 和 IPTG 的培养板。挑取蓝色克隆（即便是较弱的蓝色克隆也予以挑取），分别重悬于 96 孔板内（每孔加 100 μl 含抗生素的蛋白胨培养液）。细菌培养过夜至生长平台期，合并收集细菌，碱裂解法结合琼脂糖凝胶电泳纯化获取 pBR 质粒。
(2) 二次筛选（排除报道质粒自发突变造成的假阳性）：将获得的阳性质粒共同转化报道细胞，涂板筛选，挑取阳性克隆接种于 3 ml 含氨苄青霉素的蛋白胨培养液中，过夜培养至生长平台，分別提取各个克隆的质粒。
(3) 第三次筛选 ( 排除与靶 RNA 非特异结合造成的假阳性）：将获得的阳性质粒分別同时转化含特异性报道质粒的菌株和含非特异性报道质粒的菌株，排除在两类菌株中都能激活报道基因的克隆。
(4) 第四次筛选（排除表达质粒上随机库以外的其他部位的碱基突变产生的假阳性）：对第三次筛选得到的阳性克隆进行测序，然后按测序结果再合成阳性序列，重新克隆人 pBR，再进行一次抗转录终止检测。
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