总 RNA 提取实验(组织块中 RNA 提取及检测)

RNA 的提取通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于 RNA 酶无处不在，随时可能将 RNA 降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

RNA 提取的基本原理是利用异硫氰酸（guanidineisothiocyanale）是一类有效解偶剂，当细胞被它溶解后，蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸解离。在 4 mol/L 异硫氰酸胍和 β-巯基乙醇存在下，RNA 酶失活，可提取完整的总 RNA。

器材：

① 15 mL、10 mL、5 mL 离心管，5 mL 移液管，1 mL 可调加样器

② 匀浆器，低温高速离心机，普通离心机

③ 紫外分光光度计

试剂：

① 材料 新鲜组织 RNA 来源

② 预冷的 PBS 缓冲液

③ 变性液

④ 氯仿-异戊醇

⑤ 2 mol/L 乙酸钠（pH 4.0）

⑥ 预冷无水乙醇，预冷 75％ 乙醇，DEPC 处理水

（一）试剂的配制

(1) 变性液：异硫氰酸胍，47.3 g；十二烷基肌氨酸钠，0.5 g；2.5 mL 1 mol/L 柠檬酸钠（pH 7.0）；0.7 mL β-巯基乙醇；DEPC 处理的双蒸水，定容至 100 mL，65 ℃ 加热并搅拌助溶。

(2) 焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）处理水：加 0.2 mL 焦碳酸二乙酯到待处理的 100 mL 水中，猛烈振播使 DEPC 均匀混入水中，37 ℃ 过夜，高压灭菌（1.034 x 105 Pa, 30 min）。

(3) 乙酸钠溶液（2 mol/L，pH 4.0）：乙酸钠，54.4 g；DEPC 处理水，20 mL；用冰醋酸调 pH 至 4.0，加 DEPC 处理水至 200 mL，高压灭菌（1.034 x 105 Pa，20 min）。

(4) 氯仿-异戊醇混合液（49:1）：氯仿，49 mL；异戊醇，1 mL；混合上述液体，4 ℃ 保存。

(5) 70％ 乙醇：无水乙醇，70 mL；DEPC 处理水定容至 100 mL；混合后置 -20 ℃ 保存。

（二）RNA 提取

(1) 取已从活体上取下的组织约 1.5 g 置冰上，剪成 1 mm3 小块，加 5 mL 预冷的变性液，迅速匀浆 15~30 s。

(2) 转移入 15 mL 离心管中，加 1 mL 2 mol/L 乙酸钠（pH 4.0），翻转混合。

(3) 加 1 mL 氯仿［氯仿-异戊醇（49:1）］，翻转混合，猛烈振摇 10 s，冰浴 15 min。

(4) 4 ℃ 离心（10000 g x 20 min）。

(5) 将上层水相移入新 15 mL 离心管，加 2 倍体积冷无水乙醇，置 -20 ℃ 保持 1 h 以上。

(6) 4 ℃ 离心（10000 g x 20 min）。

(7) 弃上清液，加 2 mL 变性液重悬沉淀。

(8) 转入新管，加 2 倍体积冷乙醇置 -20 ℃ 沉淀 1 h 以上。

(9) 4 ℃ 离心（10000 g x 20 min）。

(10) 沉淀用 70％ 乙醇洗 1 次。

(11) 空气干燥，沉淀溶解在 100 μL DEPC 处理水中，-70 ℃ 贮存。

（三）实验结果及分析

(1) 取 4 μL RNA 样品，100 倍稀释后于分光光度计上测定 260 nm、280 nm 处的吸光度值。

(2) 样品 RNA 浓度（μg/mL）＝ A260 x 40（μg/mL） x 稀释倍数。A260/A280 应在 1.9~2.0 之间，如小于该值，则可能有蛋白杂质。

(1)在提取总 RNA 时一个非常值得注意的问题是防止RNA酶的混入，一般实验室的玻璃器皿、唾液和汗液都可能是 RNA 酶的污染源，故在操作时始终应戴一次性手套进行，玻璃器皿应在 250 ℃ 烘烤 4 h 以上或 180 ℃ 烘烤 9 h 以上，其他器具如电泳仪，应 3％ H2O2 浸泡 2 h 以上，用 0.2％ DEPC 处理的高压灭菌的蒸馏水冲洗 3 次以上，烘干待用。

(2)获得抽提 mRNA 的成功关键是在一开始即将内源性的 RNA 酶活性减低到最小和在操作过程中防止器皿、唾液和汗等污染。本法在一开始破碎细胞的同时使核酸酶失活，从而可得到较高的回收率。

(3) 总 RNA 在液相，DNA 及蛋白质在液相与异硫氰酸胍相之间。

(4) 停止离心机以不用刹车为好。