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RNA实验

总 RNA 提取实验(组织块中 RNA 提取及检测)

2024-06-14 RNA实验 加入收藏
简介RNA 的提取通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。但是由于 RNA 酶无处不在,随时可能将 R


简介

RNA 的提取通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解。但是由于 RNA 酶无处不在,随时可能将 RNA 降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃。

原理

RNA 提取的基本原理是利用异硫氰酸(guanidineisothiocyanale)是一类有效解偶剂,当细胞被它溶解后,蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸解离。在 4 mol/L 异硫氰酸胍和 β-巯基乙醇存在下,RNA 酶失活,可提取完整的总 RNA。

材料与仪器

器材:

① 15 mL、10 mL、5 mL 离心管,5 mL 移液管,1 mL 可调加样器

② 匀浆器,低温高速离心机,普通离心机

③ 紫外分光光度计

试剂:

① 材料 新鲜组织 RNA 来源

② 预冷的 PBS 缓冲液

③ 变性液

④ 氯仿-异戊醇

⑤ 2 mol/L 乙酸钠(pH 4.0)

⑥ 预冷无水乙醇,预冷 75% 乙醇,DEPC 处理水

步骤

(一)试剂的配制

(1) 变性液:异硫氰酸胍,47.3 g;十二烷基肌氨酸钠,0.5 g;2.5 mL 1 mol/L 柠檬酸钠(pH 7.0);0.7 mL β-巯基乙醇;DEPC 处理的双蒸水,定容至 100 mL,65 ℃ 加热并搅拌助溶。

(2) 焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)处理水:加 0.2 mL 焦碳酸二乙酯到待处理的 100 mL 水中,猛烈振播使 DEPC 均匀混入水中,37 ℃ 过夜,高压灭菌(1.034 x 105 Pa, 30 min)。

(3) 乙酸钠溶液(2 mol/L,pH 4.0):乙酸钠,54.4 g;DEPC 处理水,20 mL;用冰醋酸调 pH 至 4.0,加 DEPC 处理水至 200 mL,高压灭菌(1.034 x 105 Pa,20 min)。

(4) 氯仿-异戊醇混合液(49:1):氯仿,49 mL;异戊醇,1 mL;混合上述液体,4 ℃ 保存。

(5) 70% 乙醇:无水乙醇,70 mL;DEPC 处理水定容至 100 mL;混合后置 -20 ℃ 保存。

(二)RNA 提取

(1) 取已从活体上取下的组织约 1.5 g 置冰上,剪成 1 mm3 小块,加 5 mL 预冷的变性液,迅速匀浆 15~30 s。

(2) 转移入 15 mL 离心管中,加 1 mL 2 mol/L 乙酸钠(pH 4.0),翻转混合。

(3) 加 1 mL 氯仿[氯仿-异戊醇(49:1)],翻转混合,猛烈振摇 10 s,冰浴 15 min。

(4) 4 ℃ 离心(10000 g x 20 min)。

(5) 将上层水相移入新 15 mL 离心管,加 2 倍体积冷无水乙醇,置 -20 ℃ 保持 1 h 以上。

(6) 4 ℃ 离心(10000 g x 20 min)。

(7) 弃上清液,加 2 mL 变性液重悬沉淀。

(8) 转入新管,加 2 倍体积冷乙醇置 -20 ℃ 沉淀 1 h 以上。

(9) 4 ℃ 离心(10000 g x 20 min)。

(10) 沉淀用 70% 乙醇洗 1 次。

(11) 空气干燥,沉淀溶解在 100 μL DEPC 处理水中,-70 ℃ 贮存。

(三)实验结果及分析

(1) 取 4 μL RNA 样品,100 倍稀释后于分光光度计上测定 260 nm、280 nm 处的吸光度值。

(2) 样品 RNA 浓度(μg/mL)= A260 x 40(μg/mL) x 稀释倍数。A260/A280 应在 1.9~2.0 之间,如小于该值,则可能有蛋白杂质。

注意事项

(1)在提取总 RNA 时一个非常值得注意的问题是防止RNA酶的混入,一般实验室的玻璃器皿、唾液和汗液都可能是 RNA 酶的污染源,故在操作时始终应戴一次性手套进行,玻璃器皿应在 250 ℃ 烘烤 4 h 以上或 180 ℃ 烘烤 9 h 以上,其他器具如电泳仪,应 3% H2O2 浸泡 2 h 以上,用 0.2% DEPC 处理的高压灭菌的蒸馏水冲洗 3 次以上,烘干待用。

(2)获得抽提 mRNA 的成功关键是在一开始即将内源性的 RNA 酶活性减低到最小和在操作过程中防止器皿、唾液和汗等污染。本法在一开始破碎细胞的同时使核酸酶失活,从而可得到较高的回收率。

(3) 总 RNA 在液相,DNA 及蛋白质在液相与异硫氰酸胍相之间。

(4) 停止离心机以不用刹车为好。


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