Login
欢迎浏览恩派尔生物资料网
我要投稿 请登录 免费注册 安全退出

您现在的位置是: 首页 > 实验方法 > RNA实验

RNA实验

TRIzol RNA提取方法

2024-06-14 RNA实验 加入收藏
原理Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂,


原理

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂,是一类强力的蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

细胞裂解后,细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质,再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。


材料与仪器

细胞样品
TRIzol试剂 氯仿 异丙醇 75%乙醇 DEPC H2O
离心管 离心机 EP管 匀浆器 移液管 冰袋 漩涡振荡器

步骤

1. 样品处理:


(1) 培养细胞: 收获细胞1-5×107,移入1.5ml离心管中,加入1ml Trizol,混匀,室温静置5min。


(2) 组织:取50-100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml离心管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。


2. 加入0.2ml氯仿,振荡15s,静置2min。


3. 4℃离心,12000g×15min,取上清。


4. 加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。


5. 4℃离心,12000g×10min,弃上清。


6. 加入1ml 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4℃,7500g×5min,弃上清。


7. 晾干,加入适量的DEPC H2O溶解(65℃促溶10-15min)

注意事项

1.样品量和Trizol的加入量一定要按步骤(1)的比例,不能随意增加样品量或减少Trizol量,否则会使内源性RNase的抑制不完全,导致RNA降解。


2.实验过程必须严格防止RNsae的污染。

常见问题

一、RNA的定量计算


1.  RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此,可以用260nm波长分光测定RNA浓度,OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径,用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:


RNA(mg/ml)=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000


2.   RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0,故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低,说明有残余蛋白质存在;比值太高,则提示RNA有降解。


文章底部广告位

文章评论

加载中~